柑橘衰退病毒多克隆和单克隆抗体的制备及检测效果分析

通过改进提纯方法获得了柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）的提纯液,其产量为1mg/100g植物组织.用CTV免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,间接ELISA效价为1：25 600.用CTV免疫小鼠,经细胞融合、ELISA筛选和克隆化培养,获得18株能稳定分泌抗CTV单克隆抗体的杂交瘤单细胞株.对其中4株单克隆腹水抗体进行分析的结果表明,这些抗体的ELISA效价为1：51 200～1：204 800,其中2G和3H的抗体类型及亚类为IgG2a,1E和4H为IgG2b.用所制备抗体对不同来源柑橘样品的CTV检测结果显示,单克隆和多克隆抗体结合使用,采用三抗体夹心ELISA（TAS-ELISA）可以获得理想的检测效果,其特异性强、灵敏度高.同时发现所分析4株单克隆抗体对不同的CTV分离物鉴别能力存在差异,但有关这些CTV分离物的特性及其血清学关系还需进一步研究.

茶尺蠖核型多角体病毒多克隆抗体的制备及检测应用

以纯化的茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EcobNPV)作为抗原免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,Indirect-ELISA效价为1∶51 200;工作浓度分别为EcobNPV 1∶1 600、兔抗血清1∶3 200。用所制备的多克隆抗体对提纯的多角体进行Western-blot分析表明制得的抗体对茶尺蠖核型多角体病毒有良好的特异性。应用于不同来源茶园昆虫多角体病毒分离株的检测,取得了理想的检测效果。

葡萄卷叶伴随病毒-3外壳蛋白的原核表达及其特异性抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%～99%,编码的氨基酸相似性为95%～100%。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35kDa的蛋白。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3。

利用Gateway技术筛选Candidatus Liberibacter asiaticus致病相关基因研究

柑橘黄龙病是危害全球柑橘产业健康发展的最严重病害之一,病原为韧皮部限制性细菌,我国的柑橘黄龙病由亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CaLas)引起。由于该病原菌难以获得离体纯培养,从而限制了其致病分子机制的研究。本试验根据已经报道的植物病原细菌致病相关基因特点,从黄龙病菌亚洲种Psy62菌株全基因组序列(Psy62:NC_012985.1)中选取3个假定致病相关基因,分别标记为PalCa _(Las)、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las),利用Gateway技术的同源重组原理,将3个基因通过BP反应和LR反应,分别构建到植物表达载体psk103中,接种本生烟(Nicotiana benthamiana)后,通过瞬时表达筛选可诱导_(N.)benthamiana产生过敏性坏死反应的功能基因。经过PCR克隆和测序验证,PalCa _(Las),、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)基因均成功构建至植物表达载体上。本生烟瞬时表达试验证实:当含有目的基因的根癌农杆菌菌悬液OD600值介于_(0.)6_(~0.)^(8,)测试本生烟苗龄6周左右,PalCa _(Las)基因在接种4 dpi时可引发明显的HR(hypersensitive reaction)反应,12 dpi时HR反应更为强烈。同等条件下MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)均不能引发类似反应。由此证实,Gateway技术可成功用于筛选CaLas致病相关基因,PalCa _(Las)基因可能在CaLas致病过程中发挥重要作用。该报道为国内首次采用Gateway技术进行CaLas致病相关基因功能研究,为后续开展CaLas病原寄主互作分子机制研究奠定了基础。