CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状

大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。

大田栽培羊肚菌的病害及其综合防控技术

羊肚菌大田栽培环境条件复杂,常易发生各类病害,导致羊肚菌产量和品质下降,造成巨大的经济损失。针对羊肚菌栽培过程中常见的侵染性病害和生理性病害,文章综述其危害特点和发生规律,并结合调查研究,整合农业、物理、化学和生物等措施,总结羊肚菌大田栽培病害的综合防控技术,以期为羊肚菌的优质高效栽培提供参考依据。

优质香菇(花菇)子实体生长模型的研究

利用灰色关联度分析法(Grey Relation Analysis,GRA)对花菇品质和9个环境因子进行关联分析,确定影响花菇品质的主要环境因素后,以花菇子实体4个形态特征指标(菌盖直径、菌盖厚度、菌柄直径和子实体高度)为因变量,以花菇棚内4个环境参数(温度、相对湿度、二氧化碳浓度和光照强度)为自变量进行线性回归分析,建立基于有效积温的花菇子实体生长模型。结果表明:花菇品质与棚内的湿差、温差、光照强度的关联度最大;菌盖直径、菌盖厚度、菌柄直径、子实体高度与有效积温间分别符合Gauss模型、Cubisc Ratio模型、韦布尔函数模型和逻辑斯蒂模型。这些模型的建立可为花菇的工厂化栽培管理提供理论数据,通过对花菇不同时期的表型特征进行预测,有助于提高产量并增加生产的稳定性。

OWE-SOJ技术及核迁移试验在香菇交配型因子鉴定中的应用

由于没有明确的形态差异 ,香菇的 3种不亲和交配反应即A =B =,A =B≠和A≠B =难以互相区别。本研究将OWE SOJ技术及核迁移试验用于香菇的交配型分析。结果表明 ,应用OWE SOJ技术 ,可以观察到 3种不同的菌落形态 :由A≠B≠配对形成的具锁状联合的绒毛状菌落 ,由A≠B =配对形成的无锁状联合的栅栏型菌落及由A =B =或A =B≠配对形成的无锁状联合的绒毛状菌落。通过一个附加的常规交配试验 ,A =B =和A=B≠反应易于互相区别开来。核迁移试验表明 ,核迁移出现于A =B≠反应中而不出现于A≠B =反应中。这一结果与OWE SOJ试验的结果是一致的。因此 ,在常规交配型分析的基础上 ,应用OWE SOJ技术及核迁移试验以准确地鉴定样本中所有单核体的交配型因子是可行的。

香菇SSR-PCR技术体系的优化及其在遗传多样性分析中的初步应用

为建立稳定的香菇SSR技术体系,采用L16(45)正交试验设计,对影响香菇SSR-PCR的主要因素进行了优化筛选,建立了最佳的反应体系。在20μl反应体系中,包含1.5mmol/LMg2+,75ng模板DNA,0.25mmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物及1.5UTaq酶。梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为62℃。以该体系为基础,应用5对引物扩增8个香菇菌株的基因组DNA,扩增条带清晰稳定,聚类分析结果能较好地反映供试菌株的地理来源关系。以0.5的相似性为分割点,8个菌株可分成2大类群。类群Ⅰ主要由北方菌株组成,类群Ⅱ由南方菌株组成。该研究为SSR标记技术在香菇分子生物学研究方面的应用奠定了基础。

食用真菌空间诱变育种研究

本研究将香菇、平菇、黑木耳、金针菇、灵芝等食用菌材料进行了卫星或高空气球搭载,随之进行地面实验。结果表明,搭载材料在拮抗反应、菌丝生长速度、出菇形态等方面出现明显变异。RAPD分析的结果也证实一些搭载菌株在DNA水平上发生了变异。以上结果表明,空间诱变可能为食用菌的遗传育种提供新途径。

茯苓棚室代料栽培技术研究初报

以松木屑、松枝碎块、棉籽壳为主要培养料,采用"鲜菌核"作为"诱引",进行菇棚层架菌袋覆土和大田坑穴菌袋覆土两种栽培方式的茯苓栽培实验。其中,以松木屑和松枝碎块为主要原料的栽培料配方栽培效果优于以棉籽壳和松枝碎块为主要原料的配方;菇棚层架栽培和自然露地栽培的产量均低于大田低矮简易棚栽培,在大田搭置低矮简易棚栽培方式获得最好成活率达92.85%,平均生物学效率达18.25%,这一栽培结果与对照的段木茯苓栽培结果接近。

几种新型DNA分子标记及其在食用菌研究中的应用

综述了新型分子标记SCAR、ISSR、SRAP和TRAP的原理与特点,以及这些技术在食用菌研究中的应用现状和前景。

高等真菌基因工程研究进展

本文综述了高等真菌遗传转化所采用的选择标记和外源DNA导入受体真菌的几种方法,比较了高等真菌复制型转化与整合型转化的转化子的遗传稳定性,简述了高等真菌基因工程在工农业生产中的应用现状,展望了基因工程技术在食用蕈菌遗传育种中的应用前景。

丝状真菌基因工程研究进展

本文评述了丝状真菌基因工程的研究进展，内容涉及已被转化成功的９０余种丝状真菌种类及其所利用的选择标记，比较了几种外源ＤＮＡ进入丝状真菌受体的方法，并较为详细地评述了丝状真菌复制型与整合型转化及其转化子的有性生殖与无性生殖的遗传稳定性，最后，展望了丝状真菌基因工程在农业、工业和医药方面的应用。表明了丝状真菌基因工程具有广阔的应用前景。

OWE-SOJ技术在鉴定香菇交配反应中的应用(英文)

在香菇中 ,由于没有明确的形态差别 ,3种不亲和交配反应 ,即A =B =,A =B≠andA≠B =无法彼此区别。本研究将一种称为OWE -SOJ的新技术应用于香菇单孢分离物的对峙培养。结果表明 ,A≠B≠形成具有锁状联合的绒毛状菌落 ,A≠B =形成没有锁状联合的栅栏型菌落。A =B =和A =B≠都形成无锁状联合的绒毛状菌落 ,但通过一个附加的常规交配试验 ,二者易于相互区别。因此 ,在通常的交配试验基础上 ,应用OWE -SOJ技术准确鉴定 4种不同的交配反应是可行的。

RAPD技术在木耳属杂交种及原生质体融合子鉴定分析中的应用

本研究以ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙ－ｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）技术为主，比较分析食用菌木耳属（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）种内杂交种．种间原生质体融合子与其亲本菌株的ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒｓｅＣｈａｉｈＲｅａｃｔｉｏｎ）扩增的ＤＮＡ片段之间差异，并辅以其它手段，如核相及核数目观察，同功酶鉴别，以期建立完整有效的检测技术系列，确证其杂交种融合子的真实性及可靠性。在ＲＡＰＤ分析中，用于测试的１０种随机引物仅有４种引物与供试菌株的ＤＮＡ模板具有较好的结合能力，其中１种引物可用于检测杂交种及其亲本，另外３种引物可用于检测融合子反亲本。检测结果显示：３个供试杂交种中有２个为真杂合子，１个为假杂合子；２个供试融合子均为非稳定杂合子。与常规方法鉴定结果比较基本相符。因此，ＲＡＰＤ技术提供了一种快速、简便、准确的杂交种及融合子的鉴别方法。

应用原生质体技术培育双孢蘑菇杂交新菌株

应用原生质体技术从双孢蘑菇气生型与匍匐型二类品种中制备出原生质体同核体并进行杂交配对。结果表明，从16个组合中得到6个杂交菌株，其中2个不能结实，4个结实正常，且主要农艺性状明显优于双亲。

同工酶标记技术在金针菇品系鉴定中的应用

本文采用聚丙烯酰胺垂直板状电泳(PDGE)分析技术,研究不同生长发育期、不同组织对金针菇酯酶同工酶电泳表型的影响,筛选出不变生长发育期及常规培养条件等影响的酯酶同工酶标记区带.利用同工酶标记区带PAGE表型对不同生态型菌株进行分类鉴定.在供试8个菌株的菌丝体阶段,至少可分离出19条区带,有11条标记区带.供试8个菌株子实体发育期至少可分离出15条区带,有8条标记区带.标记区带分所有品系出现的基本带和部分品系出现的识别带,est^(100)为基本带.8个供试菌株的菌丝体酯酶同工酶标记区带PAGE表型有8种,呈多态性.子实体阶段也有7种表型.本研究在金针菇菌丝体阶段(液培10,15,20 d)3个时期、原基时期,对成熟子实体的菌柄和菌盖分别进行了酯酶同工酶检测.结果表明:酶带数最多的时期多出现在20 d和15 d,也有出现在10d.最多出现11条,最少出现5条,平均产生5.8条.标记区带最多出现7条,最少只有4条.原基时期出现区带较多,且酶带活性增加,平均产生7.4条.由于原基时期是菌丝体与子实体阶段的转折点,为此出现酶带较多(不同菌株此期的酶带数8条或7条),且酶带数相近.这与菌株的代谢调节和形态转化密切相关,显示典型的组织特异性及同工酶在组织代谢生长发育分化中的重要作用.子实体阶段菌柄、菌盖酶带数稍有减少。

紫陀螺菌的分离鉴定及其液体发酵条件的研究

为了系统性地研究外生菌根食用菌紫陀螺菌菌丝体的液体发酵体系,以紫陀螺菌子实体GPA为试材,采用组织分离和分子鉴定的方法,获得纯化后的紫陀螺菌株GP01。选用A培养基为基础培养基,通过单因素试验,研究了不同发酵温度、初始pH值、装液量、接种量、转速及发酵时间对紫陀螺菌液体培养菌丝体生物量的影响。结果表明,紫陀螺菌液体发酵的最适温度为24℃,最适的初始pH值为6.5,最适装液量为20%,最适接种量为14%~16%,最适转速为180 r/min。同时,适当增加接种量和摇床转速有助于快速提高菌丝体生物量和缩短发酵时间,但在培养基装液量相同条件下,振荡培养15 d后,a、b、c 3组处理的生物量大体相同且趋于稳定。综上所述,紫陀螺菌是一种极具开发价值的菌根性食用菌,紫陀螺菌菌丝体液体发酵相对便捷,可为后续合成紫陀螺菌菌根苗的研究奠定基础。

不同温型巨大侧耳菌株的生物学特性及液体发酵条件研究

巨大侧耳(Pleurotusgiganteus)是国内新开发的一种珍稀食用菌,具有典型的耐高温特性,在热区食用菌产业发展中具有重要地位。本团队通过前期在热区进行巨大侧耳的规模化栽培,筛选到2株具有不同出菇温型的菌株,分别适合于热区的热季和凉季栽培,可有效保障当地巨大侧耳市场的全年供应。为充分了解巨大侧耳的菌丝体营养需求和适宜培养条件,本研究以筛选到的高温型(PG46)和中温型(PG79)巨大侧耳菌株为材料,采用单因素和正交试验方法,比较和分析2株菌的生物学特性和液体发酵条件,并对液体发酵中菌丝体生长的动态变化规律进行研究。生物学特性研究结果表明:在单因素试验中,PG46和PG79的生长条件基本一致,最适碳源为麦芽糖,最适氮源为酵母浸粉和蛋白胨,最适pH为7,最适温度为25~28℃;但在30℃时,中温型菌株PG79的菌丝体开始遭受高温胁迫,菌落形态开始出现不规则现象;正交试验论证了单因素结果,且各因素对菌丝生长的影响程度均为:氮源>pH>温度>碳源。液体发酵试验结果显示:在生物学特性基础上,当摇床转速为150 r/min,装液量为120 mL,接种量为12%时,更适宜巨大侧耳菌丝体生长;PG46和PG79的菌丝体生长均呈“对数增长”的动态模式,分别在第15天(0.95 g)和第13天(1.09g)获得最高菌丝生物量,且PG79始终高于PG46,与平板上的生长速率差异一致(PG79>PG46)。研究结果可为不同温型巨大侧耳的规模化栽培、高温胁迫条件优化、杂交育种,以及深入开展巨大侧耳的表型和基因型研究提供参考。

应用AP-PCR技术检测香菇栽培菌株的遗传差异

利用3个随机引物对21个香菇栽培菌株进行PCR扩增。结果表明，3个引物共产生45条DNA谱带，其中分子量最小的为0．18kb，最大的为1．16kb，聚类分析表明，21个香菇菌株的相似系数为0．64～1．00，其中大部分菌株遗传差异较小而相似程度较高。

群体分离分析法在食用菌遗传研究中的应用进展

群体分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)是一种利用分离群体快速鉴定基因组特定区域遗传标记的方法。随着高通量测序技术的快速发展,再加上BSA简便、高效、低成本等优势,目前BSA已广泛应用于植物基因定位,但其在食用菌中的应用还处于起步阶段。综述了BSA及其在食用菌遗传研究中的应用现状,并展望其在食用菌遗传研究中的应用前景,为今后利用BSA开展食用菌遗传研究提供参考。