特异水稻脆茎突变体生物学特性及生物质降解效率的研究

水稻脆茎突变体是一种重要的种质资源。为研究该突变体在能源作物培育中的利用潜力,比较分析了10个突变体及其野生型品种日本晴(NPB)在物理特性、细胞壁组成、农艺性状、生物质降解效率等方面的差异。结果表明:水稻脆茎突变体生长发育正常,但茎秆抗张力和株高低于NPB;茎秆细胞壁纤维素含量降低,半纤维素含量增高,木质素含量增加不显著。细胞壁合成关键基因转录水平的变化与细胞壁组成一致。此外,水稻脆茎突变体的单株穗重与NPB差异不显著,有效穗数增加,生物质产量增加,抗倒伏性显著增强,秸秆易粉碎且在酸、碱预处理及纤维素复合酶酶解条件下的产糖量及纤维素降解效率显著高于NPB。这些特异水稻脆茎突变体的表型优势揭示出其在水稻秸秆利用中的应用潜力,它们可以用于高产、生物质高效降解水稻品种的培育。

藻胆体核亚基ApcD定点突变及体内重组功能研究

在对Anabaena sp.PCC7120藻胆体核亚基ApcD结合色素PCB的体内重组中,发现色素蛋白在提纯前后最大吸收峰和荧光峰发生了红移,从提纯前的605nm及633nm变为提纯后的650nm及665nm.为了研究该现象的原因,构建了ApcD的8个突变体,重组结果显示:突变体ApcD(Y88I)色素蛋白在提纯后的吸收光谱和荧光光谱较提纯前均多出一个峰,分别为668nm,690nm;ApcD(W59Q)、ApcD(Y73A)、ApcD(W87E)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱一致;ApcD(M126S)、ApcD(Y116S)、ApcD(M160T)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱一致,而提纯后的荧光峰位置较提纯前分别红移了5nm、7nm和10nm;ApcD(M115I)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱均发生了红移,从提纯前的605nm和633nm变为提纯后的638nm和655nm.这些色素蛋白在酸性尿素溶液变性条件下的最大吸收峰始终在662nm,表明辅基色素仍然是藻蓝胆素;在对PCB-ApcD、PCB-ApcD(Y116S)及PCB-ApcD(M160T)的圆二色谱分析发现,该两个氨基酸的突变均对脱辅基蛋白所连接的色素构象产生了一定的影响,而对重组蛋白的二级结构没有影响.

优质能源甜高粱突变体的筛选与鉴定

以甜高粱品种能饲一号为野生型构建EMS化学诱变突变体库,通过分析突变体可溶性糖含量、生物质总量和生物质酶解产糖效率,观察农艺性状,并测定秸秆细胞壁结构组成,筛选得到3份特异突变体材料:SM83、SM197、SM305。3份突变体除生物量皆显著提高以外,SM197与SM305半纤维素含量显著升高,而木质素和纤维素含量明显降低,导致生物质酶解产糖效率大大提高。此外,SM83的产糖效率与常规品种(对照)无显著差异,但其可溶性糖含量比野生型增加14.99%。故筛选到的甜高粱突变体是理想的生物能源种质材料,可用于优质能源甜高粱品种的培育。

蓝细菌别藻蓝蛋白ApcE与ApcF不形成复合物

进行了Anabaena sp.PCC7120的别藻蓝蛋白ApcE与ApcF的体内重组的光谱和apcE和apcF基因的细菌双杂交的研究。在提纯前PCB-ApcE/PCB-ApcF的吸收及荧光光谱峰与PCB-ApcF的峰位置一致,而提纯后PCB-ApcE/PCB-ApcF的吸收及荧光光谱峰与PCB-ApcE的峰位置一致,表明ApcE与ApcF不能形成复合物。pBT-apcF与pTRG-apcE的转化细胞能在无3氨基-1,2,4三氮唑(3-AT)的非选择性培养基上生长,而不能在有3AT的选择性培养基上生长,说明在转化过程中未产生能抗3-AT的HIS3报告基因,进一步证实ApcE与ApcF间没有相互作用。

芒草酸/碱预处理副产物的生成及对乙醇发酵的影响

研究了不同浓度酸/碱预处理下芒草预处理上清液中副产物的生成和预处理上清液发酵产乙醇的规律,并对预处理副产物与乙醇发酵的关系进行了相关性分析。结果表明:酸/碱预处理上清液中预处理副产物浓度差异较为明显,酸处理产生的糠醛、5-羟甲基糠醛浓度明显高于碱处理,而碱处理上清液中丁香酸、香草醛、对香豆酸、阿魏酸浓度明显大于酸处理;预处理上清液补糖发酵中,1%H2SO4预处理上清液糖醇转化效率高于10 g/L Na OH预处理,半纤维素含量高和木质素含量低的材料具有较高的糖醇转化效率;糖醇转化效率与相应预处理上清液中副产物浓度相关性分析显示,糖醇转化效率与5-羟甲基糠醛呈极显著正相关,相关系数达0.795,与香草醛和丁香酸分别表现为极显著和显著负相关,相关系数分别为-0.811和-0.671。

棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析

为研究XTH基因与棉花(Gossypium spp.)纤维伸长的关系,克隆了两个XTH基因,分别命名为Gh XTH1(Gen Bank:AY189971)和Gh XTH2(Gen Bank:JN968478)。Gh XTH1编码区全长870 bp,编码289个氨基酸,Gh XTH1全长885 bp,编码294个氨基酸。序列分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明,Gh XTH1和Gh XTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明,Gh XTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近,Gh XTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均随着棉花纤维发育表达量降低,Gh XTH2比Gh XTH1表达量高。

不同预处理方法对芒草酶解效率的影响

将芒草秸秆粉碎,分别采用1%H_2SO_4、1%NaOH、蒸汽爆破(SE)、1%Tween-80和SE+1%Tween-80等5种方法对芒草秸秆粉末进行预处理,然后加入纤维素复合酶进行酶解产糖,通过测定酶解上清液中六碳糖的含量来比较不同预处理方法对芒草酶解效率的影响。结果表明,采用SE+1%Tween-80预处理,芒草酶解效率最高,可达74.45%,较未处理提高了3.75～11.79倍;采用1%H_2SO_4、1%NaOH、SE或1%Tween-80预处理,芒草酶解效率较未处理分别提高了0.55～3.24倍、2.52～5.60倍、1.30～5.97倍和0～0.96倍,其中1%Tween-80预处理对芒草秸秆的酶解几乎没有任何促进作用。

水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定

纤维素合酶是参与纤维素-β1,4-葡聚糖链延伸的主要催化亚基,为进一步研究水稻中纤维素合酶的作用机理,采用DNA重组技术,将纤维素合酶基因CesA1、CesA2、CesA3克隆入表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒。在大肠杆菌JM109中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后在原核细胞中成功表达了3种纤维素合酶的融合蛋白,通过谷胱甘肽巯基转移酶(GST)纯化系统获得融合蛋白,以此作为抗原免疫家兔,制备出效价高、特异性强的多克隆抗体。

棉花纤维RNA提取方法的比较及酵母双杂交文库的构建

为了从棉花纤维中提取高质量的RNA用于构建酵母双杂交文库,采用4种不同的方法提取9天和19天棉花纤维的RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测结果表明:热硼酸法适用于初生幼嫩纤维和次生加厚纤维的RNA提取,CTAB-PVP法仅适用于初生幼嫩纤维的RNA提取,异硫氰酸胍法和高盐高pH值法提取的RNA由于杂质含量较多而影响反转录效果。采用热硼酸法大量提取总RNA,纯化后的mRNA反转录为cDNA,通过重组将扩增的cDNA片段定向插入到pGADT7-RecAD克隆载体中,得到棉纤维9天和19天的酵母双杂交cDNA文库。2个文库的滴度分别是1.01×107cfu/mL和8×106cfu/mL,cDNA插入片段长度集中分布在250～2500bp之间。由此可以看出,构建的2个棉纤维文库质量较高,可用于棉花纤维素合成和调控途径的研究。

拟南芥纤维素合酶的抗体制备与检测

将拟南芥CesA家族基因的高变区克隆到融合表达载体pGEX-4T-3中,构建重组质粒pGEX-AtCe-sAs,在大肠杆菌JM109中经IPTG诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白(GST-AtCESAs)。采用GST亲和层析法纯化GST-AtCESAs并制备了多克隆抗体。Western-blotting检测表明,抗体Anti-CESA4和Anti-CE-SA7存在明显的交叉反应,Anti-CESA1、Anti-CESA3、Anti-CESA6、Anti-CESA2、Anti-CESA5、Anti-CESA8均能在拟南芥原生质膜上检测到特异免疫条带,这为进一步深入研究拟南芥纤维素合成机制提供了有利条件。

T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统（英文）

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点"core attL"的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入p MD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到p MD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。

植物蔗糖合酶研究进展

蔗糖合酶是一种糖基转移酶,以基因家族形式广泛存在于植物中。由于蔗糖合酶家族各同源基因的时空表达模式不同,其生物学功能呈多样化。蔗糖合酶主要功能可为纤维素、胼胝质和淀粉等多糖生物合成提供底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和间接底物腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG),故在植物碳源分配中起关键调控作用,并影响相关重要农艺性状和非生物逆境响应。本文拟从其结构特征、生化功能和生物学特性等方面介绍蔗糖合酶近期研究进展,并初步提出了此类基因在植物遗传改良中的利用。

棉花GhPME1和GhPME2基因的克隆及表达分析

本研究旨在对棉花来源的果胶甲酯酶基因进行克隆和功能分析。通过RACE技术克隆了2个棉花果胶甲酯酶基因的cDNA,命名为GhPME1和GhPME2。序列分析发现:GhPME1和GhPME2的最大开放阅读框分别为1 704和1 752bp,分别编码含有567和582个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构预测显示这2个蛋白结构相似,包含PMEI和Pectinesterase结构域。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示在陆地棉的纤维发育过程中,GhPME1和GhPME2的表达峰值分别在9和4DPA(开花后天数),然后依次降低。而在海岛棉纤维中,这2个基因的表达均呈现逐渐上升的趋势,表达峰值分别出现在开花后24和29DPA。GhPME1和GhPME2在海岛棉和陆地棉棉纤维中的表达差异初步证明该基因家族的功能可能与棉纤维品质相关。

藻蓝蛋白裂合酶催化藻红胆素(PEB)与CpcA和PecA共价偶联

将由鱼腥藻Anabaenasp.PCC 7120中cpcE/F构建的pCOLADuet-cpcE/F质粒和pACYCDuet-pebA质粒、pCDFDuet-hol-pebB质粒、pETDuet-pecA质粒、pETDuet-cpcA质粒转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下,实现了色素蛋白PEB-CpcA和PEB-PecA的成功表达.吸收光谱和荧光光谱研究表明,CpcE/F能够催化PEB共价连接到CpcA和PecA的Cys-84上形成色素蛋白PEB-PecA和PEB-CpcA,色素蛋白的最大吸收峰为555 nm,最强荧光峰为570 nm.Zn2+电泳分析结果表明,体内重组获得了目标色素蛋白,证明由cpcE/F所编码的蛋白裂合酶在体内重组中能够催化PEB与CpcA和PecA的共价偶联反应,生成非天然色素蛋白PEB-CpcA和PEB-PecA.

芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响

[目的]研究芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响。[方法]选择了2组木质素含量差异显著（p〈0．01，n=3）、纤维素和半纤维素含量相近的芒草材料作底物来培养3株里氏木霉（野生型QM6a、突变型QM9414和RutC30），对诱导产生的木质纤维素酶的酶活和降解木质纤维素的效率进行分析。[结果]在第1组中，Mfl40木质素含量比Msa02低36％（P〈0．01，／Z=3），其诱导3株菌生产的木质纤维素酶体积比酶活高于Msa02组1．2～1．8倍（P〈0．05或者P〈0．01，n=3）；在第Ⅱ组中，Mfl37木质素含量比Mlu13低48％（P〈0．01，n=3），其生产的木质纤维素酶体积比酶活高于Mlu13材料1．2—3．3倍（p〈0．05或者P〈0．01，n=3）。[结论]芒草细胞壁中木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶量有显著负影响。

芒不同基因型愈伤组织诱导及分化的差异

芒(Miscanthus sinensis)具较高的生物学产量,是一种极具发展前景的纤维素类能源植物。以芒的8种不同基因型幼穗为外植体,进行了组织培养研究。结果表明,不同基因型芒在愈伤组织诱导率、胚性愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织分化率等方面均存在显著差异。W89和W70均具较高的愈伤组织诱导率,分别为91.7%和89.1%;W69的外植体几乎全部褐化,且未能诱导出愈伤组织。W89、W70和W17的胚性愈伤组织分化率较高,达50%以上。另外,发现愈伤组织诱导率与细胞壁木质素含量间呈显著的负相关。该研究建立了稳定且有效的再生体系,并初步确定W89和W70可作为芒组织培养的理想材料,为芒的遗传转化、定向改良和良种快繁提供了技术支持。

拟南芥纤维素合酶基因时空表达模式与功能预测

纤维素是细胞壁的主要组成成分,研究纤维素合成可以从源头上解决关于高效降解纤维素的问题。该研究通过综合拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维素合酶基因(AtCESA)家族的进化和芯片表达分析及根据拟南芥全生育期GUS染色结果分析纤维素合酶基因的时空表达模式,发现拟南芥纤维素合酶基因AtCESA1,3,6以及AtCESA4,7,8分别参与细胞壁初生壁和次生壁的合成并存在明显的共表达现象。其中,AtCESA1,3,6在全生育期表达,AtCESA4,7,8主要在根、茎和叶脉等次生壁细胞中表达。AtCESA5和AtCESA6、AtCESA2和AtCESA9以及AtCESA1和AtCESA10等基因对均有基因重复作用。根据AtCESA家族基因表达模式和分子演化关系可以推测,AtCESA5对AtCESA6以及AtCESA9对AtCESA2可能分别存在功能冗余。此外,AtCESA9的表达具明显的组织特异性。上述研究结果为深入认识拟南芥纤维素合酶基因的功能奠定了基础。

蛋白A-藻蓝蛋白β亚基融合蛋白的性质及应用

PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A基因spa,通过酶切位点的转换构建重组质粒pET-spa,进一步成功构建能表达融合蛋白SPA-CpcB的质粒pET-spa-cpcB.将重组质粒pET-spa-cpcB与在大肠杆菌内生成藻胆色素必需的质粒,以及藻胆蛋白裂合酶质粒,共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,生物合成融合色素蛋白.蛋白质电泳以及锌染色结果表明,体内重组分别获得了融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB.吸收光谱与荧光光谱结果表明,融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB具有与CpcB-PCB或CpcB-PEB相同的光谱特征.将SPA-CpcB-PEB与生物素标记的兔抗体进行荧光免疫反应,通过多功能微孔板荧光检测仪检测,结果表明融合色素蛋白SPA-CpcB-PEB具有SPA能与多种哺乳动物血清中的IgG的Fc段结合的特点.利用SPA-CpcB-PEB来检测包被于聚苯乙烯微量反应板的基因编码为all5292的蛋白,证实了该融合色素蛋白可用于免疫检测.