基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展

各种序列数据库的迅猛增长与生物信息软件的不断开发使基于序列资源的标记开发更加便捷,各类分子生物学技术的涌现及高通量检测平台的建设为实验室开发分子标记提供了强有力的技术支持。本文从生物信息学角度概述了SNP、SSR等分子标记开发的方法、特点及应用现状,并介绍了利用分子生物技术开发SSR、SRAP、TRAP标记的手段及从RAPD、AFLP等标记向单位点特异性PCR标记(如SCAR、CAPS、dCAPS等)转化的进展。最后,对不同植物标记开发策略的选择及以上各种技术在功能标记开发中的应用前景作了展望。

气态甲醛致小鼠骨髓细胞DNA-蛋白质交联的研究

为探讨吸入性甲醛能否对小鼠骨髓造血细胞产生遗传毒性,以SPF级昆明雄性小鼠为材料,采用动态吸入方式连续染毒72h,取骨髓细胞,测定DNA-蛋白质交联.结果发现,随着甲醛浓度的升高(0、0.5、1.0、3.0mg·m-3),小鼠骨髓细胞DNA-蛋白质交联系数逐渐升高,0.5mg·m-3组与对照组存在显著差异(p<0.05),1.0、3.0mg·m-3组与对照组存在极显著差异(p<0.01).表明,在实验浓度范围内,甲醛对小鼠骨髓细胞具有一定的遗传毒性.

一种新型有机磷降解酶的二异丙基氟磷酸酯水解特性研究

有机磷降解酶是降解有机磷化合物(包括神经毒剂)的一类重要酶.本实验室克隆了铜绿假单胞菌HS-D38的有机磷降解酶基因opd(organophosphate degradation),并经定点突变与原核表达获得了一种新型重组有机磷降解酶OPD.本文研究了该重组有机磷降解酶OPD的分离纯化,及其降解有机磷神经毒剂模拟剂二异丙基氟磷酸酯(diisopropyl fluorophosphate,DFP)的性质.研究结果表明,重组有机磷水解酶OPD经Ni-NTA亲和色谱纯化后,比活力达到了218U/mg.该酶的最适温度为35℃,最适pH为8.0;金属离子Zn2+、Cr2+、Co2+对酶活性有激活作用.重组有机磷水解酶OPD对DFP的Km为1.05mmol.L-1,Vm为0.218mmol.L-1.min-1.

DIDP通过线粒体-Caspase途径诱导昆明小鼠肝脏损伤的研究

为探究DIDP(Di-iso-decyl phthalate,邻苯二甲酸二异癸酯)对肝脏的影响及其可能的分子机制,以昆明小鼠为研究对象,选用Res(resveratrol,白藜芦醇)为抗氧化剂,分别设置对照组,0. 15、1. 5、15、150 mg/(kg·d)DIDP组,Res组,150 mg/(kg·d)DIDP+Res组,灌胃染毒9 d后,对小鼠肝脏切片进行HE染色观察,并检测ROS(reactive oxygen,活性氧)、GSH(glutathione,谷胱甘肽)、MDA(malondialdehyde,丙二醛)、Cyt-C(cytochromec,细胞色素C)、Caspase-3和血清中的ALT(alanine aminotransferase,丙氨酸氨基转移酶)含量.结果表明:与对照组相比,15、150 mg/(kg·d)DIDP组小鼠血清中ALT含量极显著上升(P<0. 01);HE染色结果显示,15、150 mg/(kg·d)DIDP组小鼠出现肝细胞水肿、肝索紊乱、肝窦以及肝中央静脉扩张等现象;15、150 mg/(kg·d)DIDP组小鼠肝脏ROS含量显著上升(P<0. 05),GSH含量显著下降(P<0. 05),150 mg/(kg·d)DIDP组小鼠肝脏MDA含量极显著上升(P<0. 01);1. 5、15、150 mg/(kg·d) DIDP组小鼠肝脏中c (Cyt-C)极显著上升(P <0. 01);15、150 mg/(kg·d) DIDP组小鼠肝脏中Caspase-3表达量极显著上升(P<0. 01). DIDP染毒剂量的增加对肝脏的各种损伤程度呈上升趋势,Res可减轻上述DIDP对肝脏造成的各种损伤.研究显示,15、150 mg/(kg·d)DIDP可诱导肝脏组织氧化应激水平上升,进而造成线粒体损伤,导致细胞凋亡,造成肝功能受损,因此,线粒体-Caspase途径可能是DIDP诱导肝脏损伤的潜在机制之一.

棉花GhRGPL2基因分离鉴定及其在组织发育和逆境胁迫中的表达调节

在棉花cDNA文库中分离了1个RGP蛋白基因同源序列,命名为GhRGPL2,编码含有359个氨基酸的RGP蛋白.随后,分离获得GhRGPL2基因全序列,基因结构分析表明:它含有3个内含子,分别位于第106和107密码子之间,第190个密码子内部,第246和247密码子之间.Northern杂交分析表明,GhRGPL2在幼根和胚珠中表达量较高.而且,该基因的表达受胚珠发育调节.GhRGPL2基因在胚珠发育早期开始表达,在开花后10 d达到表达峰值,随后基因表达活性逐渐下降.在高盐和干旱胁迫下,GhRGPL2在棉花幼根中的表达量升高.

棉铃虫c-Myc基因的原核表达纯化、抗体制备、时空表达谱测定与功能分析

细胞致瘤基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)编码的c-Myc蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路调节相关基因的表达,近年来引起了广泛的研究关注。本研究旨在利用原核表达系统体外表达棉铃虫(Helicoverpa armigera)c-Myc(Ha-c-Myc)基因,制备多克隆抗体,明确Ha-c-Myc的时空表达模式,并探究Ha-c-Myc在调控棉铃虫胆固醇载体蛋白-2(sterol carrier protein-2,SCP-2)基因表达中的潜在作用。通过PCR扩增Ha-c-Myc基因并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-32a-Ha-c-Myc,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞,使用IPTG诱导蛋白表达,并通过Ni2+-NTA柱纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫新西兰兔制备抗Ha-c-Myc多克隆抗体。利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)法检测棉铃虫不同发育时期(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和预蛹期不同组织(中肠、脂肪体、头部和表皮)中Ha-c-Myc基因的表达水平。设计合成Ha-c-Myc siRNA并转染棉铃虫Ha细胞,通过qRT-PCR分析Ha-c-Myc基因的RNA干扰后棉铃虫Ha-c-Myc基因和HaSCP-2基因mRNA表达的情况。结果表明,本实验构建了pET-32a-Ha-c-Myc重组质粒,在大肠杆菌中获得了高效表达的、大小约为65 kDa的可溶性Ha-c-Myc蛋白。经纯化得到纯度较高的蛋白,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,免疫印迹实验(Western blotting)表明抗体的特异性较好,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析显示抗体具有较高的效价。qRT-PCR实验发现Ha-c-Myc基因在棉铃虫各发育阶段均有表达,在幼龄和大龄幼虫及预蛹中表达量较高,其中预蛹的表达量最高。组织表达结果显示,Ha-c-Myc基因在预蛹不同组织均有一定表达但存在差异,在中肠部位具有高表达,而在表皮和脂肪体表达水平较低。RNA干扰的结果显示,Ha-c-Myc表达的敲降对HaSCP-2基因的转录有较大影响,导致HaSCP-2基因的相对表达水平显著性降低了50%。上述研究表明,利用pET-32a(+)原核表达系统可以有效地表达可溶性Ha-c-Myc蛋白,并且制备高质量的抗Ha-c-Myc多克隆抗体。RNA干扰证明在中肠组织高表达的Ha-c-Myc能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫的脂质代谢中具有重要作用。本实验结果有助于深入研究Ha-c-Myc在棉铃虫中的潜在功能及其作用机理,为探究绿色农药的新型作用靶标提供实验数据。

低浓度甲醛促进K562细胞增殖的分子机制探究

低浓度甲醛(Formaldehyde,FA)可以促进细胞增殖.本实验选用K562细胞为实验对象,用不同浓度的甲醛溶液处理细胞,探究其中可能存在的分子机制.测定细胞活力及胞内氧化损伤程度后,发现当甲醛浓度为75μmol·L^(-1)时,细胞增殖率上升(p<0.05或p<0.01),Warburg效应中的丙酮酸激酶M2型同工酶(PKM2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、葡萄糖和乳酸含量上升(p<0.05);此外,细胞周期调控因子Cyclin D-cdk4与转录因子E2F1含量也上升(p<0.05).同时,细胞内氧化损伤加强,其中活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量上升(p<0.01),还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)下降(p<0.05).然而,在加入抗氧化剂VE后,氧化损伤程度减弱,细胞增殖率降低,PKM2、GLUT1、LDHA、葡萄糖、乳酸,Cyclin D-cdk4、E2F1含量均下降.结果表明低浓度甲醛可能通过氧化应激诱导Warburg效应和影响细胞周期调控因子两条途径促进细胞的增殖.