尿酸对树突状细胞成熟及免疫功能的影响

目的:观察尿酸(UA)对体外培养的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)成熟及免疫功能的影响。方法:体外分离培养小鼠骨髓来源的DC,使用GM-CSF、IL-4、LPS,并加入UA诱导培养DC。用流式细胞仪技术检测BMDCs细胞表面分子表达,用MTT法检测BMDCs与同基因小鼠T淋巴细胞的混合淋巴细胞反应;ELISA法测定DC培养上清IL-12的水平。结果:通过鉴定体外成功诱导培养出BMDCs。尿酸浓度为400mg/L或200mg/L时能增强DC细胞表面CD11c、CD83、CD86、IA/IE分子表达率;提高IL-12分泌水平(P<0.05);DC与T淋巴细胞比例分别为5∶1、10∶1、20∶1时,能增强DC刺激T细胞增殖能力(P<0.05);尿酸浓度为70mg/L时,细胞表面分子表达、IL-12分泌水平、刺激T细胞增殖作用与对照组比较均无明显差别(P>0.05)。结论:对体外培养诱导扩增的BMDCs,UA可促进分化与成熟,提高表面共刺激分子表达;增强其刺激T细胞增殖能力和IL-12分泌水平。UA的作用与浓度密切相关。

TGF-β1基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的 研究转化生长因子 β1(TGF β1)基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响。 方法 将TGF β1基因导入体外培养的大鼠树突状细胞 ,经过G4 18筛选后 ,采用Westernblot和水貂肺上皮细胞 (Mv1)生长抑制试验 ,了解转染细胞TGF β1的表达及其生物学活性。通过混合淋巴细胞反应 ,观察转染的树突状细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果 TGF β1基因转染的树突状细胞可以分泌TGF β1,而且具有特异性抑制Mv1增长的生物学活性。在混合淋巴细胞反应中 ,TGF β1基因转染的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖有抑制作用 ,而空载体pcDNA3对照组与未转染组的树突状细胞具有强烈的激发T细胞增殖的能力。结论 利用构建的TGF β1表达质粒转染大鼠树突状细胞 ,转入的TGF β1基因可以在树突状细胞内稳定表达 。

柯萨奇病毒A6型VP1蛋白的生物信息学分析

目的：预测柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6,CVA6）的衣壳蛋白VP1的基本理化性质、结构功能及线性B细胞表位。方法：应用Bioedit软件、Sub Loc、Target P和生物信息学资源门户Ex PASy中的多种在线工具对CVA6 VP1的氨基酸序列进行分析。结果：CVA6 VP1为一亲水性蛋白,其相对分子量为33.6 k D,等电点为7.92,含有24个可能的磷酸化位点,没有信号肽、跨膜区和可能的脂酰化位点;其二级结构中以无规则卷曲居多,有48.52%的氨基酸残基暴露于溶液界面;该分子内存在多个潜在的线性B细胞表位,其中的155～165位氨基酸残基区域的抗原指数最高。结论：成功预测到CVA6 VP1的基本理化性质、结构功能特征及可能的线性B细胞表位,为该蛋白的进一步研究及疫苗和免疫诊断试剂的研制打下基础。

TNF结合肽和TNFR封闭肽对TNF-α体外介导的生物学抑制效应的实验研究

目的检测TNF-α结合肽(TBP)和TNFR封闭肽(TRBP)的生物学特性及功能。方法以GFP-TNF融合蛋白竞争结合实验,检测TBP和TRBP的特异性。用非变性PAGE检测TBP和TRBP的互补结合性。用细胞毒抑制实验,观察TBP和TRBP对TNF-α杀伤U937细胞的抑制作用。用硝基蓝四氮唑(NBT)还原能力和RT-PCR技术,检测TBP和TRBP对TNF-α诱导的人外周血单核细胞的呼吸爆发和对促炎症因子IL-1β和IL-8mRNA水平的抑制作用。结果TBP和TRBP能抑制GFP-TNF融合蛋白与细胞膜上TNFR的结合。非变性PAGE证明,TBP与TRBP之间的结合,为非配体和受体的结合;TBP和TRBP对TNF-α的细胞毒效应均有抑制作用,且随着剂量的增加而增强,二者联用(即pep.38+X4)效果更好。TBP和TRBP联用,能有效地抑制TNF-α和IFN-γ诱导的单核细胞呼吸爆发的强度,抑制TNF-α诱导的IL-1β和IL-8mRNA的转录。结论TBP和TRBP具有结合TNF-α和TNFR的特异性,但二者的结合为非配体和受体的相互结合。TBP和TRBP对TNF-α介导的各种生物学效应均具有抑制作用,二者联用效果更显著。

不同浓度的次级淋巴组织趋化因子对外周血单个核细胞生物学功能的影响

目的探讨人次级淋巴组织趋化因子(SLC)浓度梯度对外周血单个核细胞(PBMC)生物学功能的影响。方法根据SLC浓度,实验分为6组,通过趋化实验检测PBMC的趋化,并通过流式细胞术检测PBMC凋亡及增殖能力,ELISA检测PBMC培养上清中IL-10和IFN-γ的表达。结果一定浓度范围内,SLC可增强PBMC的迁移、抗凋亡、增殖及IFN-γ表达能力。降低IL-10的表达水平,证明上述作用具有浓度依赖性。结论SLC可通过促进PBMC迁移,增强其增殖,诱导Th1类细胞分化,提高了机体的免疫应答。

加味玉屏风散对创伤应激小鼠细胞免疫功能的影响

目的:探讨加味玉屏风散对创伤应激小鼠细胞免疫功能的影响。方法:采用小鼠截肢应激模型,检测创伤后小鼠细胞免疫功能变此。结果:创伤后小鼠细胞免疫功能受抑,包括γ-干扰素(INF-γ)水平、CD_4水平、CD_4/CD_8比值降低;转化生长因子-β(TGF-β)水平升高;核转录因子-κBmRNA(NF-κBmRNA)、白细胞介素10-BmRNA(IL-10mRNA)表达增加;高、中、低三种浓度加味玉屏风散对上述指标的变化具有不同程度的纠正作用,其中高剂量组小鼠各项指标均恢复正常。结论:创伤后小鼠细胞免疫功能受抑;加味玉屏风散可有效恢复其细胞免疫功能。

与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体,为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞,以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞,从人源噬菌体抗体库(Griffin.1Library)经三轮筛选后,阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆,通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体,通过ABI3730全自动荧光测序仪测序,并通过GeneBank比对进行同源性分析,IPTG诱导可溶性单链抗体表达,并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,并用IMGTVQuest软件进行分析,确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank,序列号为AY686498AY686499。结论从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体,为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。

家族性进行性色素过度沉着症一家系B淋巴细胞系建立及意义

目的为保证对一个汉族家族性进行性色素过度沉着症(FPH)家系致病基因研究的顺利实施,对该家系成员进行B淋巴细胞转化并建立永生化细胞系。方法采用EBV转化外周血B淋巴细胞并加用环孢霉素A。结果成功建立该家系成员永生化细胞系15个;B淋巴母细胞系(B-LCL)成功转化后其体积增大,形态多样,伸出伪足,增生的淋巴细胞多聚集成团。结论该家系成员B-LCL建系成功,为后续定位克隆FPH基因并进行皮肤色素代谢障碍的分子机制研究提供了长期的研究材料。

可与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体的表达及其特性

目的:在原核细胞中表达经噬菌体抗体库筛选可与HepG2细胞特异性结合的单链抗体(scFv),并对其特性进行鉴定。方法:采用正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2,从人源噬菌体抗体库中筛选可与HepG2细胞特异结合的scFv。对scFv DNA测序后,以其阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在IPTG诱导下表达scFv并以金属离子螯和层析(IMAC)进行纯化,用100g/L SDS-PAGE、Western blot及ELISA分析纯化的scFv。将纯化的scFv与HepG2细胞共孵育后,观察其对细胞生长的影响。结果:经筛选获得的2个相对特异性的scFv,分别命名为SLH04及SLH10。经IPTG诱导获得可溶性scFv的表达。Western blot分析证明,表达产物的相对分子质量(Mr)均为36000左右,与理论预期值相符。ELISA检测表明,纯化的scFv能与HepG2细胞特异性结合,并抑制HepG2细胞的生长。结论:从人源噬菌体抗体库中,筛选出能与HepG2细胞特异性结合的scFv,并在大肠杆菌中表达,有望用于肝癌生物治疗的实验研究。

DC单抗调节供、受体大鼠免疫功能和抑制排斥反应的研究

目的 :研究体内应用大鼠DC单抗WZD3对大鼠免疫状态的影响 ,在此基础上应用DC单抗同时处理供、受体 ,进行同种异体心脏移植 ,研究单抗诱导供、受体间双向移植耐受可能机理 ,为联合应用单抗和耐受性DC诱导移植免疫耐受奠定基础。方法 :用不同剂量WZD3处理SD(受体 )和Wistar(供体 )大鼠 ,两周后观察单向、双向混合淋巴细胞培养结果和经ConA或LPS刺激脾细胞产生的细胞因子水平变化。选择合适WZD3剂量同时对供、受体大鼠体内注射 ,进行异体异位心肺联合移植 ,术后观察移植器官存活时间和器官排斥终点时受体脾细胞分泌细胞因子水平。结果 :高剂量 (8mg kg体重 )WZD3对大鼠单向、双向MLC以及脾细胞产生IL 2和TNF有明显抑制作用 ,且能明显延长移植心脏存活时间 ;中剂量 (4mg kg体重 )和低剂量 (2mg kg体重 )WZD3对上述指标有轻度或无抑制作用。结论 :采用高剂量WZD3能下调大鼠免疫功能 ;同时处理供、受体大鼠 ,能诱导供、受体间双向免疫耐受 ,明显延长移植器官存活时间 ,其机制可能与清除DC、下调Th1细胞功能有关。

武汉地区原发性高血压代谢综合征与CYP11B2-344T/C基因多态性关系的探讨

目的:探讨武汉地区原发性高血压(EH)代谢综合征(MS)与醛固酮合成酶(CYP11B2)基因-344C/T多态性的关系。方法:701例武汉地区汉族人群分为3组,其中血压正常对照组303例,EH伴MS组189例,EH不伴MS组209例。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测3组人群CYP11B2-344T/C基因多态性。结果:(1)EH不伴MS组CYP11B2基因CC+TC基因型频率明显高于血压正常对照组。(2)CYP11B2TT基因型EH伴MS组的血压水平明显高于其它基因型。结论:EH不伴MS与CYP11B2基因多态性相关;EH伴MS患者血压水平与CYP11B2基因TT基因型明显相关。

次级淋巴组织趋化因子浓度梯度抑制肿瘤细胞免疫逃逸

目的探讨人次级淋巴组织趋化因子(SLC)浓度梯度对肿瘤细胞免疫逃逸的影响。方法根据SLC浓度梯度,实验分6组;流式细胞术检测肿瘤细胞HLA-Ⅰ类分子的表达、肿瘤细胞凋亡,Western blot检测肿瘤细胞胞内BCL-2表达,ELISA检测肿瘤细胞培养上清中生长转化因子β(TGF-β)水平。结果在一定浓度范围内,随SLC浓度增加,肿瘤细胞的HLA-Ⅰ类分子表达增高,肿瘤细胞凋亡增多;BCL-2表达增高,而肿瘤细胞TGF-β分泌水平降低。结论SLC具有抑制肿瘤细胞免疫逃逸的作用。

尿酸辅助树突细胞免疫对小鼠淋巴细胞增殖及CTL效应的影响

目的:观察尿酸辅助HBsAg蛋白负载的树突细胞免疫接种对小鼠免疫功能的影响。方法:将负载HB-sAg的小鼠骨髓来源树突细胞经尾静脉注射接种小鼠,1次/w,共2次。分DC(树突状细胞)对照组、联合尿酸组、尿酸对照组。MTT法检测体外经HBsAg或PBS重刺激的脾T淋巴细胞增殖反应;流式细胞仪法检测CTL(细胞毒性T淋巴细胞)活性。结果:免疫2周时,小鼠脾T细胞增殖反应及体内HBsAg特异性CTL的杀伤活性,联合尿酸组明显强于各对照组。结论:尿酸可促进负载HBsAg树突细胞免疫后小鼠脾T淋巴细胞的增殖及HBsAg特异性CTL效应。尿酸具有增强DC疫苗免疫效应的活性,可用作研制抗HBV的治疗性疫苗的免疫佐剂。

HSV-TK/GCV系统对前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应

目的 :研究胸苷激酶 (TK)自杀基因疗法对人前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应 ,探讨其治疗前列腺癌的可行性。方法 :采用形态学观察、活细胞拒染法及MTT法检测单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK) /羟基无环鸟苷 (GCV)系统对前列腺癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 :GCV对转染TK基因前列腺癌细胞的杀伤作用呈剂量及时间依赖关系 (P <0 .0 5～ 0 .0 1) ;但其旁观者效应较弱 ,TK基因阳性细胞比例约为 10 %的混合细胞 ,经 10 μmol/L和 10 0 μmol/L的GCV处理 72h后 ,仅有16.15 %± 1.64 %和 2 3 .46%± 3 .2 1%的细胞被杀灭。结论 :HSV TK/GCV系统对前列腺癌有杀伤作用 ,但由于其旁观者效应不够强大 。

转铁蛋白受体介导的肝癌靶向性HSV-tk/GCV系统的构建及体外效应研究

目的 :构建肝癌靶向性 HSV- tk/ GCV基因转移系统 ,并研究其在体外对肝癌细胞的杀伤效应。方法 :体外培养通过基因重组技术构建和表达抗转铁蛋白受体 ( Tf R)人 -鼠嵌合抗体的转染瘤细胞 D2 C5 .6,诱导裸鼠( Balb/ c,nu/ nu)产生腹水并纯化 ;以蛋白质连接因子 -水溶性碳二亚胺 ( EDC)介导 Tf R的抗体与多聚左旋赖氨酸的连接 ( Ab- PL L ) ,与 p EBAF/ tk按比例混匀 ,得到 Ab- PL L - p ETAF/ tk基因转移系统 ;分别转染不同的细胞株进行体外效应研究 :人肝癌细胞株 Hep G2、SMMC772 1,人肺癌细胞株 5 49,观察给予不同浓度的更昔洛韦 ( GCV)随时间延长的细胞改变情况 ,用 MTT法检测 GCV对不同细胞的杀伤作用。结果 :分析型酸性尿素凝胶电泳证实抗 Tf R的抗体与 PL L成功连接 ;体外杀伤实验显示 :经 Ab- PL L - p ETAF/ tk基因转移系统处理的 3种细胞对 GCV表现出不同的敏感性。 Hep G2细胞 ( CD71 ,AFP )对 GCV很敏感 ,低浓度的 GCV( 1mg/ L )处理 3 d,即可使细胞生长抑制率达到 74.8% ,SMMC772 1细胞 ( CD71 ,AFP+ )对 GCV低度敏感 ,A5 49( CD71- ,AFP- )对 GCV不敏感。结论 :Tf R介导的肝癌靶向性 HSV- tk/ GCV基因转移系统构建成功 ;

u-PAR反义核酸载体对高侵袭人前列腺癌细胞PC-3M亚系侵袭能力的抑制效应

目的 :观察u PAR反义核酸载体对高侵袭力PC 3M亚系侵袭能力的抑制效应。方法 :利用单层细胞侵袭和软琼脂克隆形成实验 ,对比观察u PAR反义核酸对高侵袭亚系体外侵袭能力的影响 ;应用RT PCR和明胶酶谱法 ,分析u PAR反义核酸对高侵袭亚系MMP 9活性的影响 ,并且观察u PAR反义核酸载体转染前后的细胞亚系在裸鼠体内成瘤率及转移情况。结果 :转染u PAR反义核酸的高侵袭亚系体外侵袭能力和非贴壁依赖性生长能力均明显降低 ,抑制率分别为 79%和6 0 % ;u PAR反义核酸虽不影响高侵袭亚系MMP 9mRNA的转录 ,但对MMP 9酶原的激活有抑制作用 ;且转染u PAR反义核酸载体亚系的体内成瘤率和移植瘤的生长明显受到抑制 ,与对照组之间差异具有极显著性 (P <0 .0 1)。结论 :u PAR反义核酸对高侵袭亚系体外侵袭能力有较强抑制作用 ,并可显著抑制高侵袭亚系的体内生长能力。

u-PAR反义核酸载体的构建与高侵袭人前列腺癌细胞PC-3M亚系的转染

目的 :为了特异封闭PC -3M高侵袭亚系尿激酶型纤溶酶原激活物受体 (u -PAR)的表达 ,观察其对侵袭能力的抑制效应。方法 :应用RT -PCR获得u -PAR的cDNA片段 ,反向插入pcDNA3质粒载体中 ,构建u -PAR反义核酸载体并导入高侵袭亚系中 ;借助RT -PCR和免疫组化检测转染细胞u -PAR的表达。结果 :u -PAR反义核酸载体转染株的u -PARmRNA和蛋白质水平明显低于对照组 ,抑制率分别为 53 %和 73 % ,同时其体外侵袭能力亦明显降低 ,抑制率为 79%。结论 :u -PAR反义核酸在PC -3M高侵袭亚系中发挥了特异封闭作用 ,为进一步观察u-PAR反义核酸抑制高侵袭前列腺癌细胞亚系的侵袭效应提供了细胞模型。

尿酸对HBV表位肽S_(28-39)负载DC诱导免疫效应的影响

目的观察尿酸对由HBV表面抗原表位肽负载的树突状细胞诱导免疫效应的影响。方法以负载肽S28-39的小鼠骨髓来源树突细胞,联合尿酸(uric acid,UA)尾静脉注射接种小鼠,每周1次,共2次。分为DC对照组,联合尿酸组,尿酸对照组,正常对照组。流式细胞仪法检测特异性CTL活性;ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ水平。结果体内S28-39特异性CTL,以联合尿酸接种组杀伤活性最强;联合尿酸接种组脾细胞IFN-γ分泌较对照组增高。结论尿酸能够增强乙肝表位肽负载的树突细胞诱导的S28-39特异性CTL杀伤活性;能促进免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ。尿酸具有增强负载S28-39树突细胞诱导的细胞免疫效应的活性。

TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白和TNFR Ⅰ封闭肽对TNF-α介导的生物学效应的封闭作用

目的:研究比较TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白(TNFR1BP/hIgGFc)和TNFR Ⅰ封闭肽(TNFR1BP)生物学特性及功能,为开发治疗TNF-α相关疾病的肽类药物奠定基础。方法:通过流式细胞术和细胞毒抑制实验检测TNFR1BP/hIgGFc和人工合成TNFR1BP对TNFRⅠ的封闭作用;通过RT-PCR、激光共聚焦显微镜技术检测融合蛋白和封闭肽对TNF-α介导的生物学效应的封闭作用。结果:流式细胞术证实TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白和人工合成TNFR Ⅰ封闭肽二者均能抑制TNF-α与细胞膜表面TNFR1的结合;RT-PCR结果显示二者均可明显抑制TNF-α诱导的IL-1β及IL-8等促炎细胞因子的mRNA表达;激光共聚焦显微镜显示二者均可明显拮抗TNF-α诱导的人单核细胞NF-κB核转位的发生。结论:TNFR1BP/hIgGFc和TNFR1BP均可与细胞表面TNFR Ⅰ结合,拮抗TNF-α介导的生物学效应。