Keap1-Nrf2/ARE通路在分子毒理学中的研究进展

转录因子NF_E2相关因子2(Nrf2)和它的胞质接头蛋白Keap1是细胞抗氧化反应的中枢调节者,Nrf2通过与抗氧化反应元件(ARE)相互作用,诱导编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,在细胞的防御保护中发挥重要作用。Keap1_Nrf2/ARE通路在抗肿瘤、抗应激、调节GSH合成、抗凋亡、抗炎症反应、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能。本文综述了Keap1_Nrf2/ARE通路的最新研究,重点介绍其在分子毒理学中的研究进展。

苯肽胺酸在大鼠体内的毒物动力学及组织分布

采用单次灌胃染毒法,通过高效液相色谱仪测定,研究了苯肽胺酸(N-phenylphthalamic acid,PPA)在大鼠体内的吸收、组织分布及排泄情况,以及其血药浓度经时变化过程和毒物动力学参数。结果表明:苯肽胺酸经消化道吸收速率较快,其半吸收期t_(1/2ka)仅为(0.15±0.11)h,血药浓度的达峰时间(t_(max))为(0.68±0.37)h,血药峰浓度(C_(max))值为(141.48±27.87)mg/L;苯肽胺酸在大鼠体内分布快且分布范围广,半分布期(t_(1/2α))为(0.22±0.18)h,表观分布容积(Vz/F)为(17.54±7.71)L/kg;苯肽胺酸从大鼠体内消除较快,其清除率(CLz/F)为(1.32±0.51)(L/h)/kg,在体内平均驻留时间(MRT_(0-∞))为(25.69±2.93)h,消除半减期(t_(1/2z))为(7.77±1.44)h,约35 h后95%以上的苯肽胺酸可从大鼠体内消除。研究发现:苯肽胺酸的浓度-时间曲线呈现双峰现象,提示其在大鼠体内可能存在肠-肝循环。从大鼠灌胃染毒后至24 h内,被测各组织、脏器中均可检出苯肽胺酸,其浓度由高到低依次为:肾脏>肺>肝脏>心脏>脾脏>肌肉>睾丸>脂肪>大脑,肾脏中药物含量达192.7μg/g,同时仅肾脏组织的靶向分布系数(t_e)值大于1(4.77),提示苯肽胺酸在大鼠体内分布时对肾脏具有相对较高的选择性。排泄物研究结果显示,苯肽胺酸随粪便排出的总量仅占给药量的1.45%,而尿液中未检出苯肽胺酸。

邻苯二甲酸二丁酯对雄性子代大鼠学习记忆及海马Spinophilin表达的影响

背景与目的:观察邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)暴露对子代大鼠学习记忆能力的影响和海马spinophilin基因表达的影响。材料与方法:妊娠Wistar大鼠随机分成4组:3个不同DBP剂量(25、75、225 mg/kg)的实验组和溶剂对照组,各组孕鼠于孕第6 d至产后28 d分别给予DBP或溶剂灌胃。观察孕鼠、仔鼠染毒后的基本情况,采用定量PCR检测21 d龄雄性仔鼠海马中spinophilin基因的表达情况,Morris水迷宫实验测试1月龄雄性仔鼠的学习记忆能力。结果:在实验剂量范围内,孕鼠无明显中毒表现;DBP高剂量组(225 mg/kg)雄性仔鼠肛殖距、尾长明显缩短(P<0.01)。在水迷宫实验中,DBP低剂量组(25 mg/kg)仔鼠逃避潜伏期较对照组相对延长(P<0.05),空间搜索试验中目标象限的停留时间也相对缩短(P<0.01)。低剂量组仔鼠海马spinophilin基因的表达较对照组上调35.7%(P<0.05)。结论:DBP孕期和哺乳期暴露会降低子代雄性大鼠的学习记忆能力,促进spinophilin基因的表达,两者之间可能存在一定的联系。

溴氰菊酯对大鼠脑组织线粒体膜电位和膜流动性的影响

背景与目的:研究溴氰菊酯(Deltamethrin,DM)对大鼠脑组织线粒体膜电位及膜流动性的影响。材料与方法:成年雄性Wistar大鼠一次性腹腔注射12.5mg/kg体重DM(溶剂为色拉油),5h、24h、48h、72h后处死,提取皮层和海马的线粒体,分别测定线粒体膜电位、膜流动性、Na+-K+、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶活力。同时设立对照组,只注射色拉油0.5ml/100g,5h后处死大鼠。结果:大鼠经DM处理后,5h、24h、48h、72h组的线粒体膜电位下降,膜流动性降低,Na+-K+、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶活力受到抑制,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01),并且与染毒后时间成直线相关关系。结论:DM能明显损害大鼠脑组织线粒体功能,继而引起线粒体氧化磷酸化障碍。

溴氰菊酯对大鼠脑白介素-1β表达的影响

背景与目的:观察给予溴氰菊酯(deltamethrin,DM)后大鼠大脑皮层、海马及下丘脑IL-1β的变化,初步探讨DM对神经免疫功能的影响。材料与方法:雄性SD大鼠共65只,其中15只用于RT-PCR,25只用于免疫组化,另25只用于ATPase活力测定,均随机分为1个对照组和4个DM不同作用时间的实验组。实验组中大鼠一次性腹腔注射溴氰菊酯12.5mg/kg,给药后1、6、24和48h分别检测上述3个脑区中IL-1βmRNA表达和蛋白含量的变化,同时以Na+-K+-ATPase为神经毒性指标,测定上述各时间点3个脑区Na+-K+-ATPase活力,探讨DM不同作用时间与IL-1β之间的关系。结果:皮层IL-1β含量在给药后1~6h升高,而IL-1βmRNA表达的增加在24h^48h与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),但未观察到ATPase活力的变化;给药后1h海马IL-1β含量升高,随之在6h时ATPase活力降低,在24h时IL-1βmRNA出现短暂升高和ATPase活力的恢复,48hATPase活力再度降低;下丘脑IL-1βmRNA的表达在给药后1h开始升高,6h时达峰值,IL-1β蛋白含量24h后才升高,ATPase活力仅在1h时一过性降低。结论:在DM对大鼠中枢神经系统不同脑区的毒作用过程中IL-1β可能发挥不同的作用。

半数效量分析模型在小鼠血清溶血素测定中的应用

目的 应用半数效量分析模型建立小鼠血清溶血素半数溶血值(HC50)新的计算公式。方法 小鼠血清溶血素分光光度测定法测定正常小鼠血清在不同稀释度的溶血反应率,用半数效量分析模型对测定值进行曲线拟合,建立计算小鼠血清半数溶血值(HC50)的新方法并与原计算方法作统计学比较。 结果1)小鼠血清对数稀释倍数与溶血概率单位符合半数效量分析模型,曲线拟合良好,直线方程为 y=11.4238-2.1911x,r=0.9978,相关系数显著性检验P<0.01,由方程建立的小鼠血清半数溶血值(HC50)概率单位法计算公式为HC50 = lg-1[lg(N)+(5-y)/b]。2)概率单位公式法可在溶血反应率为2.9～97.8%的较大范围内准确计算血清样品溶血素的半数溶血值(HC50),与理论值的误差率范围为2.81～8.30%;与原方法计算结果(误差率范围为4.65～77.11%)比较,除溶血反应率为52.5%的测定值点外,各溶血反应率测定值点的计算结果误差率均有显著性差异(P<0.05)。概率单位公式法计算结果与光密度比值法比较,具有更高的准确性。 结论 小鼠血清对数稀释倍数与溶血概率单位符合半数效量分析模型,由此建立的概率单位公式法可在样品血清较大溶血反应率范围内准确计算血清样品溶血素的半数溶血值。

IL-1β在溴氰菊酯诱发谷氨酸释放中的作用

目的探讨IL-1β与Glu在溴氰菊酯(DM)神经毒性中的关系。方法分离雄性SD大鼠皮层、海马和下丘脑,消化成单细胞悬液置37℃培养,3个脑区的细胞均分为对照组:给予体积分数为0.1%DMSO;DM组:给予2×10-6mol/L DM;DM1组:给予2×10-6mol/L DM同时加10μmol/L IL-1β转化酶抑制剂Ac-YVAD-CHO;DM2组:给予2×10-6mol/L DM后15 min加10μmol/L Ac-YVAD-CHO;DM3组:给予2×10-6mol/L DM同时加15μmol/L Ac-YVAD-CHO;DM4组:给予2×10-6mol/L DM后15 min加15μmol/L Ac-YVAD-CHO,每组3个平行样,DM作用1 h后收集培养上清,高效液相色谱(HPLC)法测上清中Glu释放量。结果DM可显著促进皮层和海马神经细胞的Glu释放,但抑制下丘脑细胞Glu释放;皮层和海马各抑制剂组Glu的释放均显著低于DM组但仍高于对照组,DM作用后15 min给予10μmol/L,Ac-YVAD-CHO对皮层细胞的Glu释放的抑制作用较先给予同等剂量的抑制剂作用强(P<0.01);对海马神经细胞,15μmol/L抑制剂对DM诱导Glu释放的抑制作用较10μmol/L抑制剂作用强,DM作用后15 min再给予15μmol/L较先给予15μmol/L抑制剂的抑制作用强;而Ac-YVAD-CHO对DM诱导下丘脑细胞谷氨酸(Glu)释放的抑制作用各抑制组间无差别。结论IL-1β促进了DM对皮层和海马神经细胞Glu的诱导作用。

溴氰菊酯染毒大鼠的脑组织中GCS亚单位和Nrf2表达的时间进程

目的研究溴氰菊酯(DM)对大鼠大脑皮层和海马组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)轻亚单位(GCSl)和重亚单位(GCSh)mRNA表达,以及GCSh和转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)基因蛋白表达时间进程的影响。方法DM染毒组(DM12·50mg/kg bw)和溶剂对照组大鼠染毒1次,分别于大鼠染毒后不同时间点处死大鼠,分离皮层和海马。用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定mRNA表达的相对量。联合用免疫组织化学方法和图像分析系统检测海马和大脑皮层中GCS重亚单位蛋白(GCS-HS)和Nrf2蛋白的水平。结果(1)DM染毒后第5h和第48h大鼠大脑皮层中GCSh mRNA相对水平分别降低至对照组的83·9%、86·0%(P<0·05),第5h、24h和48h Nrf2mRNA分别增高至0h对照组的146·4%、145·2%和147·9%(P<0·05)。(2)DM染毒后第5h和24h海马中GCSh mRNA相对水平分别增高至0h对照组的118·4%、118·4%(P<0·05),第5h海马中GCSl mRNA比0h对照组、24h和48h组均高,增高至对照组的121·4%(P<0·05)。DM染毒后各时间点海马Nrf2mRNA水平未见明显的变化(P>0·05)。(3)DM染毒后海马不同分区(CA1、CA2、CA3和齿状回)和大脑皮层中的GCS催化亚单位(GCS-HS)和转录因子Nrf2蛋白水平均未见明显改变。结论本实验条件下DM染毒后,大鼠海马GCSh和GCSl mRNA基因表达出现上调,而脑皮层GCSh基因表达出现下调,Nrf2mRNA水平表达出现上调,但海马和皮层组织中的GCS-HS和Nrf2蛋白水平未见显著变化。

体外培育牛黄的诱变性研究

目的 :对体外培育牛黄的诱变性进行研究。 方法 :采用Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、人外周血淋巴细胞体外培养染色体畸变试验等方法进行检测。 结果 :①Ames试验在1250、5000、10000μg/皿的浓度范围内 ,各浓度组MR值在加代谢活化剂S9 和不加代谢活化剂S9 两种情况时均未超过2 ;②微核试验在50、150、500mg/kg3个剂量水平 ,各剂量组的微核率均数及PCE/NCE比值与空白对照组比较均未见显著性差异(P>0.05) ;③人外周血淋巴细胞体外培养染色体畸变试验在样品浓度为1、10、100μg/ml(不加代谢活化剂 ,-S9)和1、10 μg/ml(加代谢活化剂 ,+S9)两种情况下 ,各处理组测得的细胞畸变率与空白对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。 结论 :体外培育牛黄在所给剂量范围进行的3种诱变性试验结果均为阴性。

血红素氧化酶-1在急性镉中毒大鼠肾皮质中的表达

背景与目的:观察急性镉中毒大鼠肾皮质中血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达的变化。材料与方法:健康雄性SD成年大鼠24只,随机分为4组,3个染镉组连续5d分别腹腔注射0.4、0.8、1.6mg/kg氯化镉(CdCl2);对照组连续5d腹腔注射生理盐水。给药结束后5d取双肾皮质分别进行RT-PCR及免疫组织化学分析,观察HO-1mRNA及蛋白表达的变化。结果:对照组观察到HO-1的生理性表达。在mRNA水平,0.4mg/kg组未见表达增加,0.8及1.6mg/kg组较对照组明显升高(P<0.05)。mRNA与染镉剂量呈剂量-效应关系(r=0.97,P<0.05)。免疫组化结果显示,肾皮质HO-1蛋白表达的变化较mRNA敏感。在蛋白水平,3个试验组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:镉的急性毒性作用可诱导肾脏表达HO-1增高,其表达可能具有保护作用。

软骨藻酸诱导PC12细胞凋亡及对活性氧的影响

[目的]研究软骨藻酸诱导PCl2细胞凋亡及对活性氧的影响。[方法]流式细胞仪法测定0、0.01、0.1、1μmol/L软骨藻酸作用PCl2细胞24h后,对细胞凋亡、细胞周期和活性氧生成的影响。[结果]软骨藻酸可诱导PCl2细胞凋亡的发生,与对照组(凋亡率为0.250±0.053)相比,所有染毒浓度组PCl2细胞凋亡率均上升且差异有统计学意义;并将PCl2细胞阻滞于细胞周期中的G2/M期,0.1、1μmol/L组中处于G2/M期的PCl2细胞数量与对照组相比,差异具有统计学意义;所有浓度组均可使PCl2细胞的活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)平均荧光强度增加(0.01μmol/L组为187.140±3.629,0.1μmol/L组为206.023±5.277,1μmol/L组为348.915±3.343),与对照组(163.660±4.059)相比,差异均具有统计学意义。[结论]软骨藻酸能诱导PCl2细胞凋亡的发生,将PCl2细胞阻滞于细胞周期中的G2/M期,并使得细胞内的ROS产生增加。

乙嘧酚磺酸酯诱发CHO和L5178Y细胞基因突变的研究

目的:采用体外培养细胞基因突变试验,评价乙嘧酚磺酸酯原药对中国仓鼠卵巢CHO细胞基因HPRT立点和小鼠淋巴瘤L5178Y细胞基因TK位点的诱变性。方法:使用乙嘧酚磺酸酯原药对CHO细胞和L5178Y细胞进行染毒,实验设置5、15、50、150μg/ml共4个浓度组,分别对CHO细胞进行集落形成率,HPRT位点突变频率的测定;对L5 178Y细胞进行接种效率,相对存活率,TK位点突变频率的测定。结果:随着乙嘧酚磺酸酯原药剂量的逐渐增高,CHO细胞的集落形成率较阴性对照组明显降低(P<0.01);L5178Y田胞的平板接种效率和相对存活率与阴性对照组相比均明显下降,但是设计的4个剂量组基因突变率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:在本实验条件下,乙嘧酚磺酸酯原药对CHO细胞和L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,但其对细胞基因HPRT应点和TK位点的突变率无明显影响。

肥胖小鼠胰腺组织肿瘤相关基因突变频率的分析

目的:检测肥胖小鼠胰腺组织中癌基因Kras,抑癌基因Trp53、Smad4的突变,初步探讨肥胖与胰腺组织肿瘤相关基因突变的关系。方法:将雄性C57BL/6小鼠分为两组,分别以普通食物和高脂食物饲养24周,测量其体质量、进食量、体成分和血脂水平。提取高脂食物组小鼠胰腺组织的DNA,设计引物并通过高保真DNA聚合酶扩增Kras基因第2外显子,Trp53基因第8外显子,Smad4基因第9外显子的基因片段,进行DNA测序。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫组化方法检测细胞增殖标志基因Ki67在胰腺内的表达水平。结果:24周高脂食物饲养引起小鼠肥胖。与普通食物组相比,高脂食物组小鼠的体质量、摄入单位质量饲料的体质量增长量、体脂质量、肝体比、附睾脂肪脂体比均显著增高(P均<0.05),血浆中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平也显著上升(P<0.05)。qPCR结果显示,高脂食物组小鼠胰腺组织Ki67mRNA的水平显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示,高脂食物组小鼠胰腺内存在多个Ki67阳性的胰腺导管细胞,提示胰腺细胞增殖活性升高。同时,检测到胰腺癌促癌基因Kras在肥胖小鼠中Kras基因CDS序列的第96位碱基由T突变为C(突变频率为2%)。结论:肥胖可能会增加胰腺组织中Kras基因的不稳定性,从而起到促进胰腺癌发生、发展的作用。

NF-κB抑制剂干预前后软骨藻酸对PC12细胞存活率的影响

目的研究核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂(PDTC)干预前后软骨藻酸(DA)对PC12细胞存活率的影响。方法免疫荧光细胞化学法测定软骨藻酸对PC12细胞NF-κB蛋白的影响;MTT法检测PC12细胞的存活率。结果随着DA染毒剂量的升高,PC12细胞NF-κB表达均升高(P<0.05);PDTC干预后,PC12细胞存活率均升高。结论DA可诱导PC12细胞NF-κB表达增加;PDTC具有一定的保护作用,可明显提高PC12细胞的存活率。

母代营养过剩对雄性子代能量代谢的影响

目的探究母代营养过剩对雄性子代能量代谢的影响。方法 C57BL/6J雌鼠随机分为高脂饮食组和正常饮食组,分别饲喂高脂或正常饲料2个月,然后与正常饮食C57BL/6J雄鼠交配,孕鼠在孕期和哺乳期继续摄取高脂或正常饲料。子一代雄鼠性成熟后与正常饮食C57BL/6J雌鼠交配得到子二代,子二代雄鼠性成熟后再与正常饮食C57BL/6J雌鼠交配得到子三代。测定子一代、子二代、子三代雄性小鼠体重、摄食量及随机血糖值。对子一代和子二代成年雄性小鼠进行腹腔糖耐量实验并记录肝脏、附睾周脂肪、皮下脂肪湿重值。检测子二代成年雄性小鼠血清胰岛素及下丘脑能量代谢相关基因表达情况。结果营养过剩母鼠子一代和子二代雄性小鼠的体重、摄食量、能量摄入量及随机血糖值均高于对照组(均P<0.05),子三代之间的差异则无统计学意义(P>0.05)。营养过剩母鼠子一代和子二代的成年雄性小鼠的附睾周脂肪脂体比、皮下脂肪脂体比、肝体比及糖耐量曲线下面积均高于对照组(均P<0.05)。营养过剩母鼠子二代成年雄性小鼠的血清胰岛素浓度及下丘脑神经肽Y(NPY)、刺鼠相关蛋白(AGRP)、甘丙肽(GAL)、可卡因-安他非明转录调节肽(CART)、SIM1基因的表达量均高于对照组(均P<0.05)。结论高脂饮食诱导的营养过剩母代对雄性子代能量代谢的影响可持续至子二代,引起子二代下丘脑能量代谢相关基因表达异常。

溴氰菊酯对大鼠神经系统的氧化应激作用

目的 观察溴氰菊酯(DM)在大鼠大脑皮层和海马组织诱导的脂质过氧化作用。方法 DM3.12 5、12 .5 0 0mg/kg染毒大鼠,测定其大脑皮层和海马组织丙二醛(MDA)水平和总超氧化物歧化酶(T SOD ,包括Mn SOD和CuZn SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S 转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH Px)和谷胱甘肽还原酶(GR)活力。脑组织细胞质碎片γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)活力和GSH含量用OPA柱前衍生反相高效液相色谱荧光法检测。结果 DM染毒5d ,(1) 12 .5 0 0mg/kgDM组大鼠大脑皮层MDA含量高于3.12 5mg/kgDM组,海马MDA含量高于对照组和3.12 5mg/kgDM组。(2 )两组DM染毒大鼠大脑皮层T SOD和CuZn SOD活力均低于对照组,差异均有统计学意义(P <0 .0 1或P <0 .0 5 )。(3) 12 .5 0 0mg/kgDM组大鼠大脑皮层GSH含量高于对照组,海马GSH含量低于对照组和3.12 5mg/kgDM组;3.12 5mg/kgDM组大鼠大脑皮层GR活力[(11.80±5 .15 )U/mgpro]低于对照组和12 .5 0 0mg/kgDM组[(18.98±3.6 8)、(17.35±2 .4 7)U/mgpro],3.12 5、12 .5 0 0mg/kgDM组大鼠海马GR活力[(2 1.4 6±8.89)、(2 1.6 3±4 .92 )U/mgpro]均低于对照组[(31.2 2±6 .97)U/mgpro];12 .5 0 0mg/kgDM组海马γGCS活力[(1.75±0 .6 0 )