高三尖杉酯碱等四种药物的体外抑制乙肝病毒的实验研究

探讨高三尖杉酯碱、干扰素α1b、羟基喜树碱和诺氟沙星这四种药物对乙肝病毒的体外抑制作用。利用HBV全基因组转染的人肝癌细胞系(HepG2.2.15),采用CPE方法观察四种药物对HepG2.2.15的毒性大小,在最大无毒浓度下,将药物加入HepG2.2.15培养8天收集培养液,用ELISA法和荧光定量PCR法分别测定药物对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg及HBV-DNA的抑制作用。结果显示在体外高三尖杉酯碱和干扰素α1b对乙肝病毒均有明显的抑制作用,羟基喜树碱对乙肝病毒仅有一定的抑制作用,诺氟沙星则在各浓度均未见对乙肝病毒有抑制作用。本实验证实了高三尖杉酯碱在体外对乙肝病毒有明显的抑制作用,为临床抗乙肝药物的研究提供了一定的理论依据。

乙型肝炎病毒感染性复制子构建及其意义

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)感染性复制子表达载体,建立HBV体外复制细胞模型,分析其复制特性及对抗病毒药物的敏感性。方法以质粒pHBV-dimer为模板,采用PCR结合限制性酶切的方法分步将1.3拷贝HBV基因组克隆到pCR2.1载体。将构建的pHBV1.3质粒转染Huh7细胞,ELISA检测不同时间HBsAg、HBeAg的表达,Southern Blot和Northern Blot分析HBV复制中间体、转录物。并利用该细胞模型进行阿德福韦抗病毒研究。结果成功构建了HBV感染性复制子表达质粒,该质粒上HBV基因能在Huh7细胞中进行有效复制、转录和表达,并能在体外短期传代12 d。阿德福韦能体外抑制该HBV复制子的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论新构建的HBV感染性复制子表达载体可介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。

新的抗病毒核苷类似物替比夫定体外对乙型肝炎病毒复制子的抑制作用

目的:观察新的抗乙型肝炎病毒(HBV)核苷类似物——替比夫定体外对乙型肝炎病毒复制子的抑制作用。方法:将乙型肝炎病毒复制子pHBV1.3质粒转染Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg的表达,荧光定量PCR(FQ-PCR)定量检测培养上清中HBVDNA拷贝数,Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果:替比夫定减少了培养上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论:替比夫定在体外对HBV复制有较强的抑制作用。

反复自然流产孕妇流产组织中人细小病毒B19的检测意义

目的探讨HPV B19感染与反复自然流产(RSA)的关系。方法建立人细小病毒B19巢式PCR检测方法,检测RSA孕妇流产组织和正常妊娠人工流产组织中HPV B19 DNA。结果检测HPV B19的巢式PCR方法具有很好的特异性和敏感性;42例RSA孕妇流产组织中HPV B19 DNA阳性率26.2%(11/42),40例正常妊娠人工流产组织中HPV B19 DNA阳性率2.5%(1/40),两组HPV B19感染率差异有统计学意义(x2=9.20,P<0.01)。不同流产次数组HPV B19 DNA阳性率差异无统计学意义(x2=0.06,P>0.05)。结论HPVB19感染可能与反复自然流产的发生有关。

活动性巨细胞病毒感染与反复自然流产的关系探讨

目的探讨活动性人巨细胞病毒(hum an cytom egalovirus,HCMV)感染与反复自然流产(recurrent spontane-ous abortion,RSA)的关系。方法采集反复自然流产孕妇和正常产前体检孕妇外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs)和血浆,分别用免疫荧光法和实时定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果65例RSA患者HCMV pp65抗原有20例阳性,阳性率30.8%,50例正常体检孕妇HCMV pp65抗原有4例阳性,阳性率8.0%,2组孕妇HCMV活动性感染率有显著性差异(χ2=8.87,P<0.01)。孕妇HCMV pp65抗原阳性率升高,孕妇流产几率增加(χ2=7.53,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(92.3%)。结论反复自然流产孕妇HCMV活动性感染率显著高于正常孕妇,HCMV pp65抗原检测也许可作为RSA早期诊断指标之一。

人细小病毒B19感染与习惯性流产的关系探讨

目的:探讨人细小病毒B 19(Human parvovirus B 19,HPVB19)感染与习惯性流产(Recurrent pregnancy loss,RPL)的关系。方法:建立人细小病毒B 19巢式聚合酶链反应(Nested Polymerase chain reaction,NestedPCR)检测方法,采集习惯性流产孕妇流产组织和正常妊娠人工流产组织,用巢式PCR方法检测流产组织中HPV B 19 DNA。结果:56例RPL孕妇流产组织中HPVB 19 DNA有16例阳性,阳性率28.6%,50例正常妊娠人工流产组织中HPVB19 DNA有2例阳性,阳性率4.0%,2组HPV B19感染率有显著性差异(χ2=12.38,P<0.01)。流产次数与HPV DNA阳性率无显著性关系(χ2=0.03,P>0.05)。结论:RPL孕妇HPV B 19感染率显著高于正常孕妇,HPV B 19感染可能导致习惯性流产的发生。

习惯性流产孕妇巨细胞病毒pp65抗原检测的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染与习惯性流产(RPL)的关系。方法:采集习惯性流产孕妇和正常产前体检孕妇外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs)和血浆,分别用免疫荧光法和实时定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV-DNA,并比较2种方法的一致性。结果:46例RPL患者HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率30.4%,50例正常体检孕妇HCMV pp65抗原有4例阳性,阳性率8%,2组孕妇HCMV活动性感染率有显著性差异(2χ=6.76,P<0.01)。孕妇HC-MV pp65抗原阳性率升高,孕妇流产几率增加(2χ=6.39,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(93.5%)。结论:习惯性流产孕妇HCMV活动性感染率显著高于正常孕妇,HCMV pp65抗原检测可作为RPL早期诊断指标之一。

乙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

单克隆抗体是由识别一种抗原表位的B细胞产生的同源性抗体，具有特异性强、纯度高、效价高、无或少血清学交叉反应等优点，在临床和科研中得到了广泛应用。目前对乙型肝炎病毒的相关发病机制还在进一步探索，特别是在建立动物模型方面还有很多问题需要解决，如土拨鼠肝炎病毒核心抗原是否与人源型的核心抗原存在交叉反应等等都需要尽快弄清楚。我们将原核表达截短型乙型肝炎病毒核心抗原（HBc144）纯化后免疫BALB／C小鼠，制备出了抗乙型肝炎病毒核心抗原的两株单克隆抗体，并对其特异性、亲和力、抗原表位等性质进行了鉴定，

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞INF-α和IL-8表达的检测及临床意义

目的检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞α干扰素(IFN-α)的诱导表达及白细胞介素8(IL-8)表达,评价慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)细胞免疫功能。方法PolyIC体外刺激正常对照组和慢性乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染组病人PBMC,取培养上清液利用病毒保护试验测定IFN-α2b治疗前后病人PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性。同时在IFN-α2b治疗前后,RT-PCR检测慢性乙肝患者不同干扰素应答组病人PBMCIL-8表达的变化。结果治疗前应答组病人(n=13)和无应答组病人(n=27)PBMC分泌的干扰素生物学活性显著低于正常对照组(n=20)(P<0.01;P<0.01)。应答组病人PBMC分泌的干扰素活性随治疗时间延长而增加,1个月时已显著高于无应答组病人(P<0.01);无应答组病人PBMC分泌的干扰素活性始终处于低下水平。治疗前,应答组病人和无应答组病人PBMCIL-8mRNA水平都显著高于正常对照组(均为P<0.01);治疗后,应答组病人IL-8水平随治疗时间延长而降低,1个月时已显著低于无应答组病人(P<0.01),无应答组病人IL-8水平始终处于较高水平。结论慢性HBV感染病人的细胞免疫功能受损,不能正常表达IFN-α,但应答组病人经干扰素治疗后IFN-α表达能力逐渐恢复。慢性乙肝患者PBMCIL-8表达与肝脏炎症活动有关。慢性乙肝患者PBMCIFN-α活性检测结果也许可以作为干扰素治疗预后的判断指标。

通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达

目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析。方法:限制性内切酶EcoRV酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1:640。结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析。

替诺福韦体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的观察抗乙型肝炎病毒(HBV)核苷类似物替诺福韦体外对HBV复制的抑制作用。方法噻唑蓝(MTT)比色法检测药物对细胞的毒性作用。将乙型肝炎病毒复制子pHBV1.3质粒转染HepG2细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替诺福韦,然后在不同时间段观察替诺福韦的抗病毒作用。ELISA检测培养上清中HbsAg,HBeAg的表达,荧光定量PCR(FQ-PCR)定量检测培养上清中HBV DNA拷贝数,Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果替诺福韦降低了培养上清中HbsAg,HBeAg水平及HBV DNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替诺福韦对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论替诺福韦在体外对HBV复制有较强的抑制作用,有望用于临床治疗慢性乙型肝炎。

高效表达型T克隆载体的构建及其特性

目的研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析。方法限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果成功构建了表达型T载体,外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达1∶640。结论新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析。

HepG2．2．15细胞培养上清液中HBVDNA及其抗原的检测

乙型肝炎病毒（HBV）是一种引起急性和慢性坏死炎症性肝病及肝细胞癌的DNA病毒。HBV具有特异嗜肝性、非细胞损伤与裂解、易发展为慢性等特征。HepG2．2．15细胞是能够表达HBV抗原和分泌完整HBV颗粒的肝胚瘤细胞系，也是目前用来研究HBV复制．肝细胞对干扰素（IFN）应答最为合适的细胞模型系统。

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞IFN-α和IL-12的表达及临床意义

目的检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)α干扰素(IFN-α)的诱导表达及白细胞介素12(IL-12)表达,评价慢性乙肝患者PBMC的细胞免疫功能。方法poly IC体外刺激正常对照组和慢性乙肝病人PBMC,取培养上清利用病毒保护试验测定干扰素治疗前后病人PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性。同时在IFN-α治疗前后,用RT-PCR检测慢性乙肝患者不同干扰素应答组病人PBMC IL-12表达的变化。结果干扰素治疗前应答组病人(n=4)和无应答组病人(n=12)PBMC分泌的干扰素生物学活性显著低于正常对照组(n=10)(P<0.01)。应答组病人PBMC分泌的干扰素活性随治疗时间延长而增加,1个月时已显著高于无应答组病人(P<0.01);无应答组病人PBMC分泌的干扰素活性始终处于低水平。治疗前,应答组和无应答组病人PBMC的IL-12 mRNA水平都显著高于正常对照组(P<0.01);治疗后,应答组病人IL-12水平随治疗时间延长而降低,1个月时已显著低于无应答组病人(P<0.05),无应答组病人IL-12水平始终处于较高水平。结论慢性乙型肝炎病人的细胞免疫功能受损,PBMC不能正常表达IFN-α,但应答组病人经干扰素治疗后IFN-α表达能力逐渐恢复。慢性乙肝患者PBMC IL-12表达与肝脏炎症活动有关。慢性乙肝患者PBMC IFN-α活性检测结果也许可以作为干扰素治疗效果的预测指标。

一种新的土拨鼠α干扰素基因分型方法的建立及其意义

目的:建立新的土拨鼠α干扰素(IFN-α)基因分型方法,分析急性和慢性土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepati-tis virus,WHV)感染的土拨鼠肝细胞中不同型别的IFN-α基因表达谱及其意义。方法:利用已知序列和基因型的土拨鼠IFN-α基因克隆质粒,建立基于土拨鼠IFN-α基因序列的限制性片段长度多态性的土拨鼠IFN-α基因分型方法。PolyIC体外刺激正常土拨鼠外周血单个核细胞(PBMC),调查正常土拨鼠PBMC受PolyIC刺激后IFN-α基因的表达谱。提取急性和慢性土拨鼠肝炎病毒感染的土拨鼠肝组织mRNA,RT-PCR扩增土拨鼠IFN-α基因,分子克隆后调查急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因表达谱。结果:建立了土拨鼠IFN-α基因限制性片段长度多态性分型方法。急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因的表达谱明显不同于正常动物的表达谱,假基因表达所占比例大。结论:新建立的土拨鼠IFN-α基因分型方法可用于分析土拨鼠不同组织中IFN-α的基因表达谱。

儿童抽动-秽语综合征HCMV pp65抗原检测的临床意义

目的探讨儿童巨细胞病毒(Hum an cytom egalov irus,HCMV)活动性感染与抽动-秽语综合征(T ourette’s sym-drom e,TS)的关系。方法离心分离64例抽动-秽语综合征患儿和40例正常儿童外周血单个核细胞(PBM C s)和血浆,分别用免疫荧光法和定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果64例TS患儿HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率21.9%,40例正常儿童HCMV pp65抗原有1例阳性,阳性率2.5%,2组儿童HCMV感染率有显著性差异(2χ=7.49,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(89.1%)。结论抽动-秽语综合征儿童HCMV感染率显著高于正常儿童,HCMV活动性感染可能诱发抽动-秽语综合征。

慢性HCV感染者外周血单个核细胞IL-18和IFNAR1检测的临床意义

目的分析慢性丙肝(CHC)患者外周血单个核细胞(PBMC)白细胞介素18(IL18)mRNA的诱导表达及α干扰素受体1(IFNαreceptor1,IFNAR1)表达,评价慢性丙肝患者PBMC细胞免疫功能。方法脂多糖(LPS)体外刺激正常对照组和慢性丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染组病人PBMC,RTPCR检测干扰素治疗前后PBMCIL18mRNA水平的变化。同时RTPCR检测不同组PBMCIFNAR1mRNA水平的差异。结果治疗前干扰素应答组病人(n=12)和无应答组病人(n=26)PBMCIL18mRNA诱导表达水平显著低于正常对照组(P<0.01;P<0.01);治疗后,应答组病人IL18mRNA水平随治疗时间延长而升高,1个月时显著高于无应答组病人(P<0.01),无应答组病人IL18mRNA水平始终较低。IFNα2b治疗期间,干扰素应答组病人PBMCIFNAR1mRNA水平从治疗前的高表达而逐渐减少,正常对照和干扰素无应答组病人PBMCIFNAR1mRNA的表达始终较低(治疗前与应答组相比P<0.01)。结论慢性HCV感染病人的细胞免疫功能受损,不能正常表达IL18和IFNAR1,但应答组病人经干扰素治疗后表达能力逐渐恢复。慢性丙肝患者PBMCIL18mRNA和IFNAR1mRNA水平检测也许可以作为干扰素治疗预后的判断指标。

慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞IL-12和α干扰素受体1的检测及意义

全球约有3．5亿人血清中携带乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原，中国的HBV感染情况尤其严重，携带率高达109，6以上。目前临床治疗慢性乙型肝炎的主要方法依然是干扰素（IFN）结合核苷类药物，虽然重组干扰素的应答率经过多年来不断的技术改进而有所增强，但患者的反应率还是不能令人满意。慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗应答出现差异的原因还不十分清楚，为此我们试图从机体自身的外周血单个核细胞（PBMC）研究出现这种差异的机制，这里我们对用IFN-α治疗的不同慢性乙型肝炎患者PBMC分泌的IL-12和α干扰素受体1的表达作了检测和分析。

现场检测中标本的抗凝和运送

现场检测（POCT）也称床边检测或就地检测，指在患者旁边进行的临床检测。通常不一定由临床检验师来操作，POCT的主要特点是不需要固定的检测场所，试剂和仪器是便携式的，并且可及时操作。由于能快速、简便和及时地检测患者的临床指标，缩短了患者治疗转换周期，有效地消除了一些试验的影响因素，其应用前景越来越广。POCT使用最多的是血液标本，其中一些检测对标本抗凝和运送有着严格的要求。下面就一些常见检测项目的血液标本抗凝和运送加以阐述。

乙型肝炎病毒及其抗原成分对干扰素信号传导途径分子和抗病毒蛋白表达的影响

目的了解HBV及其抗原成分对干扰素（IFN） α Janus激酶-信号传导和转录激活子（JAK-STAT）信号传导途径分子和抗病毒蛋白表达可能存在的影响。方法以人肝胚瘤细胞株HepG2细胞为研究对象，分别经质粒转染（以能够表达完整HBV病毒颗粒或HBsAg、HBcAg的质粒pSM2、pHBS2-S和pHBc-EGFP）、病毒感染（以HepG2．2．15细胞培养上清液感染HepG2细胞，其含有完整HBV病毒颗粒和HBV抗原）以及与HBV抗原直接接触刺激等方式处理不同组HepG2细胞，以Northern blot和RT-PCR等方法分析各处理组HepG2细胞的IFN α应答情况，如检测抗病毒蛋白【如粘病毒抵抗蛋白A（MxA）、2＇-5＇寡腺苷酸合成酶（2＇-5＇OAS）、9-27等】和JAKSTAT信号传导途径分子（如STATl）的表达。对数据进行t检验。结果转染pSM2、pHBS2-S和pHBc-GFP质粒后，HepG2细胞能够表达完整的HBV颗粒或HBV抗原，且随着转染时间的延长，HBV颗粒或抗原表达量逐步增多，转染48、96h的细胞培养上清液中HBsAg的S／CO值为0．81±0．1l和2．35±0．33（t=lO．84，P〈0．05），HBeAg的S／CO值为0．69±0．06和1．79±0．13（t=18．82，P〈0．05）。Northemblot分析提示HepG2细胞能够表达IFNα抗病毒蛋白MxA、2’，5’OAS、9-27等，但质粒转染、病毒感染和HBV抗原直接接触刺激的HepG2细胞，IFNQ抗病毒蛋白MxA、2’，5’OAS、9-27等的表达量明显减低，且随着转染时间的延长而进一步减低；此外，STATl的表达也随着HBV颗粒或HBV抗原的表达而受到抑制。结论在体外细胞模型中，HBV及其抗原成分影响IFNα JAK-STAT信号传导途径分子和抗病毒蛋白的表达；HBV具有拮抗或反作用于IFNα抗病毒活性的机制。