静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.

多发伤病人外周血髓系细胞触发受体-1的表达与意义

目的探讨多发伤病人外周血中髓系细胞触发受体-1(TREM-1)转录水平的表达规律及其临床意义。方法收集30例临床多发伤病人和7例健康志愿者外周血,提取白细胞,以半定量RT-PCR检测外周血白细胞TREM-1 mRNA水平表达,并分析其临床意义。结果对照组TREM-1 mRNA半定量比值为0.48±0.072,多发伤病人1,2,3和7 d外周血TREM-1 mRNA半定量比值分别为0.89±0.063,0.94±0.070,0.83±0.095,0.66±0.063,差异有显著意义(P<0.05)。伤后第1天和第2天,ISS≥16组TREM-1表达显著高于ISS<16组(P<0.001)。伤后第2天和第7天,脓毒症组表达水平显著高于非脓毒症组(P<0.01 )。结论多发伤病人TREM-1 mRNA表达升高,在创伤早期与ISS评分相关,且在脓毒症的发生中起重要作用。

髓系细胞触发受体1在胆道感染患者中的表达

目的 了解胆道感染患者外周血髓系细胞触发受体 1(TREM 1)在转录水平上的表达规律及其意义。方法 收集 3 2例胆道感染患者 (研究组 )和 7例健康志愿者 (对照组 )外周血标本 ,以半定量RT PCR检测白细胞TREM 1mRNA表达水平 ;ELISA检测血清TNF α表达水平。结果 对照组TREM 1mRNA半定量比值为 0 .48± 0 .0 72 ,研究组 1,2 ,3 ,7天外周血TREM 1mRNA半定量比值分别为 0 .93± 0 .0 70 ,0 .90± 0 .0 60 ,0 .82± 0 .0 92和 0 .66± 0 .0 62 ;与对照组相比 ,差异有显著意义 (P<0 .0 5 )。急性重症胆管炎组患者第 1天和第 7天TREM 1mRNA半定量比值高于非重症胆管炎组 (P<0 .0 5 )。TREM 1与TNF α表达水平高度正相关 ( r =0 .75 2 ,P <0 .0 0 1)。结论 TREM 1表达上调可能在胆道感染脓毒症的发生中起重要作用。

u-PAR反义核酸载体对高侵袭人前列腺癌细胞PC-3M亚系侵袭能力的抑制效应

目的 :观察u PAR反义核酸载体对高侵袭力PC 3M亚系侵袭能力的抑制效应。方法 :利用单层细胞侵袭和软琼脂克隆形成实验 ,对比观察u PAR反义核酸对高侵袭亚系体外侵袭能力的影响 ;应用RT PCR和明胶酶谱法 ,分析u PAR反义核酸对高侵袭亚系MMP 9活性的影响 ,并且观察u PAR反义核酸载体转染前后的细胞亚系在裸鼠体内成瘤率及转移情况。结果 :转染u PAR反义核酸的高侵袭亚系体外侵袭能力和非贴壁依赖性生长能力均明显降低 ,抑制率分别为 79%和6 0 % ;u PAR反义核酸虽不影响高侵袭亚系MMP 9mRNA的转录 ,但对MMP 9酶原的激活有抑制作用 ;且转染u PAR反义核酸载体亚系的体内成瘤率和移植瘤的生长明显受到抑制 ,与对照组之间差异具有极显著性 (P <0 .0 1)。结论 :u PAR反义核酸对高侵袭亚系体外侵袭能力有较强抑制作用 ,并可显著抑制高侵袭亚系的体内生长能力。

u-PAR反义核酸载体的构建与高侵袭人前列腺癌细胞PC-3M亚系的转染

目的 :为了特异封闭PC -3M高侵袭亚系尿激酶型纤溶酶原激活物受体 (u -PAR)的表达 ,观察其对侵袭能力的抑制效应。方法 :应用RT -PCR获得u -PAR的cDNA片段 ,反向插入pcDNA3质粒载体中 ,构建u -PAR反义核酸载体并导入高侵袭亚系中 ;借助RT -PCR和免疫组化检测转染细胞u -PAR的表达。结果 :u -PAR反义核酸载体转染株的u -PARmRNA和蛋白质水平明显低于对照组 ,抑制率分别为 53 %和 73 % ,同时其体外侵袭能力亦明显降低 ,抑制率为 79%。结论 :u -PAR反义核酸在PC -3M高侵袭亚系中发挥了特异封闭作用 ,为进一步观察u-PAR反义核酸抑制高侵袭前列腺癌细胞亚系的侵袭效应提供了细胞模型。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pET-23a(+),构建pET-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3);PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别.利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础.……

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学研究

目的研究获得性肺炎(HAP)产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的耐药性及ESBLs基因型。方法回顾性分析18例感染产ESBLs肺炎克雷伯菌患者的临床资料,采用酶抑制剂增强法作ESBLs表型确证试验,纸片扩散法作药敏试验,聚合酶链反应(PCR)扩增ESBLs基因。结果产ESBLs肺炎克雷伯菌的阳性率为78.3%;仅对亚胺培南、美罗培南敏感;几乎所有患者均存在不规范使用抗生素、应用糖皮质激素、接受侵袭性操作等;SHV、CTX-M和TEM基因的阳性率分别为72.2%、61.1%和16.7%;44.4%的菌株同时携带多个基因。结论HAP产ESBLs肺炎克雷伯菌阳性率高、耐药情况严重,治疗应首选碳青霉烯类抗生素;不规范使用抗生素、应用糖皮质激素、接受各种侵袭性操作可能是其危险因素;最常见的ESBLs基因型是SHV,其次为CTX-M。

吡非尼酮改善自发性高血压大鼠心肌及主动脉纤维化

目的探讨吡非尼酮能否改善高血压导致的心脏及主动脉纤维化。方法Wistar-Kyoto大鼠(WKY)10只,自发性高血压大鼠(SHR)12只。适应性喂养后利用简单随机方法分为4组:WKY+溶剂组(n=5),WKY+吡非尼酮组(n=5),SHR+溶剂组(n=6),SHR+吡非尼酮组(n=6)。分别予以生理盐水或吡非尼酮(200 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,持续8周。连续监测大鼠尾动脉血压。8周后,心脏超声测定大鼠心脏结构和功能变化,病理实验检测大鼠心脏及主动脉形态变化,分子生物实验测定纤维蛋白原和波形蛋白等纤维化标志物水平。结果SHR尾动脉压明显高于WKY(均为P<0.01),吡非尼酮干预与生理盐水干预相比,大鼠血压无统计学差异。与WKY+溶剂组相比,SHR+溶剂组心肌血管周围和间质胶原含量分别增加了131.3%和126.9%,纤维蛋白原和波形蛋白表达含量分别增加了112.0%和241.0%(均为P<0.01)。与SHR+溶剂组相比,SHR+吡非尼酮组心肌血管周围和间质胶原含量分别下降了41.1%和44.9%,纤维蛋白原和波形蛋白表达含量分别下降了43.3%和42.2%(均为P<0.01)。胸主动脉染色显示,与SHR+溶剂组相比,SHR+吡非尼酮组胶原含量减少了29.3%,SHR+吡非尼酮组纤维蛋白原含量下降了26.5%(均为P<0.01)。弹力纤维染色显示,SHR+溶剂组较WKY+溶剂组弹力纤维含量减少了37.9%,SHR+吡非尼酮组较SHR+溶剂组弹力纤维含量增加了61.0%(P<0.01)。结论吡非尼酮不影响大鼠血压,但可缓解SHR心肌和主动脉纤维化,减轻心肌和主动脉重构,改善主动脉弹性。

酶解米糠蛋白分离提取ACE抑制肽及其结构研究

研究酶解米糠蛋白中具有ACE抑制活性短肽组分及其序列,本实验采用等电点沉淀法提取米糠蛋白,经胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等单独或联合水解米糠蛋白,并采用Sephadex G-15凝胶层析和SP-Sephadex C-25离子交换层析分离各酶解组分。ACE抑制活性检测结果显示:酶解组分中含有较高抑制活性成分,其相对分子量在500单位以内。各组中活性最高的组分进行HPLC-MS分析,其中活性最高的胃蛋白酶联合胰蛋白酶酶解活性组分主要为Arg-Tyr、Met-Trp、Gly-Val-Tyr或Gly-Asp-Phe,其共同特征是C端具有苯环样结构,提示:这种环结构可能是ACE抑制剂的重要结构特征。

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制

目的探讨川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法建立血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖模型,用酶促反应定磷法观察不同浓度的川芎嗪在不同时段内对血管平滑肌细胞中钙调蛋白和钙调神经磷酸酶活性的影响。结果与正常对照组比较,血管紧张素Ⅱ组能够明显刺激血管平滑肌细胞增殖,血管紧张素Ⅱ处理的血管平滑肌细胞的钙调蛋白和钙调神经磷酸酶活性及细胞增殖活度均较正常对照组显著增高(P<0.01)。同时加川芎嗪处理后,各组钙调蛋白和钙调神经磷酸酶活性均显著下降(P<0.01)。结论川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖有显著抑制作用,其抑制机制可能与其干预钙调神经磷酸酶依赖的信号转导途径有关。

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖中CaN活性及增殖细胞核抗原表达水平的影响

目的:观察川芎嗪对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)中钙调神经磷酸酶(CaN)活性及增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平的影响。方法:建立AngⅡ诱导VSMCs增殖模型,应用免疫细胞化学法观察血管平滑肌细胞PCNA表达;并用酶促反应定磷法测定CaN活性。结果:AngⅡ组能够明显刺激VSMCs增殖,VSMCs细胞数目和细胞增殖活度明显高于正常对照组(P<0.01);CaN活性和PCNA表达量(A值)显著高于正常对照组(P<0.01)。同时加川芎嗪处理,各组CaN活性和PCNA表达水平均显著低于AngⅡ组(P<0.01)。结论:川芎嗪对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖有显著抑制作用,其机制与抑制CaN介导的信号转导进而抑制PCNA的表达有关。

内质网应激介导过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨氧化应激诱导心肌细胞凋亡是否与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的调控机制有关。方法给予乳鼠心肌细胞高低两种浓度(500、100μmol/L)和不同时间(0、4、8、12、24h)过氧化氢(H2O2)刺激。采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡率;苏木精-伊红染色法(HE)观察心肌细胞凋亡的典型形态;通过Western blot检测ERS标志蛋白p-PERK和CHOP的表达变化。进一步采用ERS抑制剂化学伴侣PBA(4-phenylbutyric acid)抑制心肌细胞ERS,Western blot检测p-JNK、p-PERK和CHOP蛋白的表达变化;采用流式细胞仪检测Caspase-12和Caspase-3的活性。结果①低浓度H2O2可显著诱导心肌细胞凋亡,高浓度H2O2则导致心肌细胞发生坏死;100μmol/L H2O2刺激心肌细胞8h时其凋亡率最高。②心肌细胞发生凋亡时ERS标志蛋白p-PERK和CHOP表达显著增高。③ERS抑制剂PBA预处理心肌细胞,可有效抑制H2O2诱导的p-PERK、CHOP表达及Caspase-3、Caspase-12活性的上调,与单纯H2O2处理组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论低浓度H2O2可通过促发ERS整合调控机制介导心肌细胞凋亡。这一结果将从ERS整合调控细胞应激的角度为心血管疾病的防治提供新思路。

褪黑素对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞分泌的细胞因子的影响

目的 观察褪黑素 (melatonin ,MLT)对小鼠移植性肝癌生长的抑制作用及对小鼠腹腔巨噬细胞分泌的细胞因子的影响。方法 建立肝癌小鼠模型 ,连续 2周每日皮下注射MLT ,绘制肿瘤生长曲线并采用放射免疫法测定小鼠腹腔巨噬细胞分泌的IL 1β和TNF α的水平。结果 注射MLT的小鼠肿瘤生长速度明显 <阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,腹腔巨噬细胞IL 1β的诱生水平明显提高 (P <0 .0 5 ) ,但TNF α的水平却明显下降。结论 MLT能显著抑制小鼠移植性肝癌的生长 ,它对荷瘤小鼠的巨噬细胞功能具有选择性调节作用。

SOCS1/SOCS3在冠心病患者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的探讨SOCS1和SOCS3在冠心病发病中的作用,进一步了解冠心病的发病机制。方法应用real time-PCR及Western blot法检测正常健康人(对照组,n=10)和冠心病患者(冠心病组,n=30)外周血单个核细胞中SOCS1/SOCS3的mRNA和蛋白表达水平,同时用ELISA法检测血浆中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1水平。结果 SOCS1、SOCS3的mRNA和蛋白在冠心病组[SOCS1:(1.95±0.77),(1.19±0.43);SOCS3:(3.60±1.35),(1.35±0.59)]的表达水平明显高于对照组[SOCS1:(1.18±0.43),(0.58±0.33);SOCS3:(1.16±0.67),(0.87±0.35)],差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较,冠心病患者血浆IL-1β[(22.2±8.1)vs.(13.6±5.9)],IL-6[(33.1±14.2)vs.(19.1±9.1)],IL-12[(25.0±5.5)vs.(11.5±2.9)],IL-17[(25.0±10.4)vs.(13.4±5.6)],TNF-α[(29.5±12.0)vs.(17.8±6.4)],IFN-γ[(20.3±10.7)vs.(10.4±3.8)]水平显著上升,而IL-4[(8.3±3.4)vs.(16.4±7.4)],IL-10[(14.9±7.2)vs.(38.7±16.9)]和TGF-β1[(122±52)vs.(361±117)]水平明显下降(单位均为pg/mL),两组间的差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 SOCS1和SOCS3的高表达可能参与冠心病的发病,其机制可能与冠心病患者体内促炎细胞因子水平升高有关。

人脐带间充质干细胞外泌小体保护缺氧复氧损伤的心肌细胞

目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)外泌小体对心肌细胞缺氧复氧损伤后细胞凋亡的作用,并分析外泌小体内具有心脏保护作用的微小RNA(microRNA,miRNA)表达水平。方法:酶消化法培养HUMSCs并对其免疫表型进行流式细胞术鉴定;收集培养的第3代HUMSCs上清液,利用试剂盒提取外泌小体,电镜观察其形态结构,并采用Western blot法鉴定试剂盒所提物质CD63蛋白水平的表达;用提取的外泌小体处理缺氧复氧条件下的心肌细胞,流式细胞术Annexin V-FITC/PI标记法观察外泌小体对心肌细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测外泌小体中miRNA的表达水平;miR-22抑制剂处理缺氧复氧条件下的心肌细胞,流式细胞术检测心肌细胞的凋亡。结果:流式细胞术检测第3代HUMSCs的CD105、CD73和CD90呈高表达,而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR的表达阳性率低,说明第3代培养的HUMSCs具有间充质干细胞的特异性表型特征。向骨细胞分化诱导HUMSCs,钙结节形成明显,经茜素红染色呈红色结节,分化率为(92.5±5.1)%以上。经向脂肪细胞分化,细胞见脂滴形成,油红染色将脂滴染成红色,分化率为(91.6±3.8)%以上,说明第3代培养的HUMSCs具有间充质干细胞的多向分化能力。扫描电镜观察可见外泌小体球状结构,并且外泌小体特异性蛋白CD63表达强阳性。缺氧复氧导致心肌细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。在缺氧复氧条件下,外泌小体处理使心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。不同浓度外泌小体处理心肌细胞,其抗细胞凋亡作用无明显变化(P>0.05)。实时荧光定量PCR检测外泌小体中富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139-5p,其中miR-22表达水平最高;在缺氧复氧条件下miR-22抑制剂处理心肌细胞,细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论:人脐带间充质干细胞外泌小体可有效减少缺氧复氧条件下的心肌细胞凋亡,其抗凋亡作用与外泌小体富含的miR-22密切相关。

可溶性PD-1协同HSP70-肽复合物抑制荷瘤小鼠肝癌的研究

目的 :研究基因转染和表达的可溶性PD 1(solubleprogrammeddeath 1,sPD 1)对HSP70 肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制。方法 :以HSP70 肽疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,用半定量RT PCR技术检测和分析HSP70 肽疫苗对小鼠脾细胞上PD 1及其配体基因表达的影响。体内转染表达sPD 1,用MTT比色法检测HSP70 肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性。结果 :单独的sPD 1就有抗肿瘤效应。HSP70 肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL ,而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD 1及其配体的表达显著升高。用sPD 1与HSP70 肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠 ,能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70 肽疫苗的免疫效果。结论 :sPD 1可通过阻断PD 1与其配体的结合作用 ,及减弱PD 1的负反馈抑制作用 ,而增强HSP70

肿瘤组织中Tim-3表达的特征及其在肿瘤免疫耐受中的作用

目的:研究小鼠肿瘤发生早期两型含T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(Tim3)的表达特点,以及与免疫调节相关基因表达的时空关系,并探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法:建立小鼠实体瘤模型,采用RTPCR法检测肿瘤组织中可溶型Tim3(sTim3)和膜型Tim3(flTim3),以及叉头盒P3(forkheadboxP3,Foxp3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关受体(GITR)、TGFβ、IL10和IFNγ等在不同时相的表达及相应时相肿瘤的生长情况。结果:在早期的肿瘤组织中,sTim3的表达先于flTim3,其后flTim3大量表达,而sTim3的表达则下调直至消失。Foxp3和GITR随flTim3同时表达并逐步上调。CTLA4的表达先于flTim3,并随着时间的推移表达上调。flTim3同Foxp3的表达具有空间位置的一致性。flTim3、Foxp3和CTLA4的表达水平同肿瘤的生长呈正相关。结论:随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节。flTim3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中发挥着重要作用,而sTim3可能起着不同的作用。

板蓝根对脂多糖诱导P38丝裂原活化蛋白激酶的影响

目的 :探讨板蓝根抗内毒素活性部位F0 2 2 对内毒素介导的细胞内信号传递的影响。方法 :取BALB/C小鼠腹腔内单核细胞 ,实验组分别用 1.0 0 0 ,0 .5 0 0 ,0 .2 5 0和 0 .12 5mg·mL 1 板蓝根F0 2 2 部位样品液 +脂多糖 (LPS)液 (10 0μg·mL 1 ) ,阳性组直接用LPS液 (10 0 μg·mL 1 ) ,阴性组用 1%F0 2 2 液处理单核细胞 ,检测细胞内P3 8丝裂原活化蛋白激酶(P3 8MAPK)活性。结果 :实验组单核细胞内P3 8MAPK浓度较阴性组稍高 ,但比阳性组低 ,抑制率随板蓝根F0 2 2 部位浓度降低而下降。抑制率分别为 95 .66%,64 .80 %,3 9.2 8%和 2 0 .67%。结论 :板蓝根对脂多糖诱导的P3 8单核细胞内丝裂原活化蛋白激酶活性有抑制作用 ,抑制强度呈剂量依赖性。

雷公藤内酯醇对人胃癌细胞SGC7901增殖及表达血管内皮生长因子的影响

目的:研究雷公藤内酯醇(TL)对人胃癌细胞SGC7901增殖及表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:采用增殖抑制试验(MTT法)了解TL对SGC7901细胞的增殖抑制作用,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)了解TL对VEGFmRNA表达的影响,采用免疫组织化学方法了解TL对VEGF蛋白表达的影响。结果:12.5～200ng/mL的TL作用于人胃癌细胞SGC790112～48h,其生长和增殖都受到一定程度的抑制,并且呈剂量和时间依赖性;TL作用于人胃癌细胞SGC790124h,下调VEGFmRNA及VEGF蛋白的表达(P<0.01)。结论:TL可以通过抑制肿瘤细胞VEGF的表达而发挥抗肿瘤作用。