人精子RNA的提取及含量分析

目的建立可靠的提取人精子RNA的方法，分析其含量并用于检测基因mRNA。方法9例正常精液标本液化后，经Percoll纯化，用体细胞裂解液（含0．1％十二烷基硫酸钠和0．5％Triton X-100的水溶液）于O℃处理15min去除精子以外的细胞。用RNeasy Kit提取精子RNA，微量核酸测定仪测定RNA量。RNA用于逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），检测β-Actin、精子特异性阳离子通道2（CatSper2）、鱼精蛋白2（Protamine-2）mRNA，同时，检测c-Kit、CD4、上皮细胞钙粘蛋白（E-Cadherin）mRNA，分别排除生精细胞、白细胞和上皮细胞的污染。结果体细胞裂解液于0℃处理15min能去除精子以外的细胞，使精子RNA提取量提高（2．2～4.9倍）。9例正常精液标本RNA量为（233．5±75．3）ng／10^6精子。所有标本RNA用RTPCR，均成功扩增β-Actin、CatSper2、Pmtamine-2，但扩增c-Kit、CD4、E-Cadhefin未见目的条带。结论人精子中含微量RNA，本提取方法能提取人精子中微量RNA，且避免其他细胞污染，可供人精子RNA研究和临床检测选用。

CatSper1在小鼠睾丸发育过程中的动态表达及与人精子活力的关系

目的研究CatSper1 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化,并探讨CatSper1蛋白表达与精子运动的关系。方法采用荧光实时逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)相对定量法检测CatSper1 mRNA在出生后11、15、18、21、25、28、35、42、56和120 d龄C57BL/6小鼠(每天龄3只)睾丸中的表达;分别从4例正常精液标本中用四层密度梯度Percoll(浓度分别为95%、76%、57%和47.5%)离心分离出高活力和低活力精子,用于Western Blot定量检测CatSper1蛋白的表达。结果CatSper1 mRNA在18 d龄小鼠睾丸开始表达,在25和28 d龄表达上调明显,分别为21 d龄表达水平的2.95和7.59倍。自42 d后上调缓慢,至成年小鼠时达到最高水平。CatSper1蛋白在每例标本高活力精子中的表达量均显著高于低活力精子(P<0.05)。结论CatSper1与精子活力特性有关,为进一步研究CatSper家族各成员间的关系和确切功能提供参考依据。

无精子症患者精液Y染色体微缺失检测与分析

目的建立用无精子症患者精液进行Y染色体微缺失检查的简便方法，并用于检测我国无精子症患者Y染色体微缺失的发生情况和位点。方法无精子症患者241例，取精液标本（其中51例有血液标本），45例正常精液标本作为对照，快速裂解提取DNA，用4组多重PCR检测分布于AZFa、AZFb、AZFc区共15个序列标签位点（STS）的缺失。PCR产物测序证实无精子症患者精液为模板扩增的准确性，琼脂糖凝胶电泳观察精液标本和相应血液标本PCR产物的一致性。结果所有多重PCR反应均成功进行，产物测序证实为目的片段。正常精液未检测到Y染色体微缺失，而无精子症患者共检测到26例（10．8％）Y染色体微缺失，均有欧洲男科学会（EAA）和欧洲分子遗传学质量控制体系（EMQN）推荐STS位点的缺失：AZFa区、AZFb区各2例（各占7．7％），3例（11．5％）位于AZFb＋AZFc区，19例（73．1％）位于AZFc区。血液标本检测结果与精液标本检测结果完全一致。结论用无精子症患者精液进行Y染色体微缺失检查是可行、可靠的。初步表明EAA／EMQN推荐STS位点适合我国无精子症患者Y染色体微缺失检查。

第二极体数目与受精结局及胚胎发育潜能的相关性

目的 探讨第二极体数目与卵母细胞受精结局和胚胎发育潜能之间的关系.方法 根据受精后5 h内卵母细胞极体数目的 不同分为1个极体组（1PB组）、2个极体组（2PB组）、3个极体组（3PB组）和4个以上极体组（≥4PB组）.分别统计各组的正常/异常受精率（2PN率,1PN和3PN率）、优质胚胎率（优胚率）、移植胚胎所占比例以及相应着床率.采用χ2检验对数据进行统计学处理.结果 ① 2PB组的2PN率显著高于其它组,而异常受精率显著低于其它组;随着第二极体数目的 增加,异常受精比例逐渐增加;② 2PB组和3PB组的胚胎着床率显著高于1PB组,以2PB组为最;③ 2PB组和3PB组用于移植的胚胎比例无显著差异.结论① 短时受精后显示有两个极体的卵母细胞其受精结局和发育潜能优于其它极体数目的 胚胎;② 随着第二极体数目的 增加,异常受精比例逐渐增加,可能与卵母细胞减数分裂或基因调控异常有关;③ 1PB组的总受精率高达48.9 %.因此,短时受精后对于仅显示一个极体的卵母细胞需要延长观察时间,谨慎确定受精与否,以防止过度早补救ICSI;④ 1PB组的着床率显著低于2PB组,也不建议首选用于移植.