左旋多巴诱发异动症大鼠模型纹状体神经元可塑性的研究

目的 研究左旋多巴诱发异动症 (LID)大鼠模型纹状体区FosB和特异性神经肽基因表达的变化 ,探讨LID时纹状体神经元的可塑性。方法 分别用免疫组织化学方法和逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)检测大鼠纹状体区FosB和前脑啡肽原 (PPE)及前强啡肽原 (PDyn)基因的表达情况。用辣根过氧化物酶 (HRP)逆行示踪与免疫组织化学相结合的双重反应技术观测FosB的细胞分布状况。 结果 帕金森病 (PD)大鼠较正常大鼠损毁侧纹状体PPEmRNA表达明显增多而PDynmRNA表达减少。LID大鼠较PD大鼠PPEmRNA无明显增多 ,但PDynmRNA显著性增多。LID大鼠损毁侧纹状体区FosB阳性神经元明显增多 ,并且主要分布于纹状体黑质神经元内。结论 纹状体黑质神经元内即早基因FosB及其下游靶基因强啡肽的表达异常与大鼠LID的发生有关 ,表明LID的发生与直接通路的活动异常密切相关。

格尔德霉素通过诱导热休克蛋白反应抑制DA能神经元蛋白水解应激的研究

目的探讨格尔德霉素(geldanamycin,GA)通过诱导热休克蛋白(HSP)反应抑制α-突触核蛋白(α-syn)异常表达,加强泛素蛋白酶体降解功能的神经保护作用。方法鱼藤酮作用于NGF诱导的PC12细胞建立α-syn胞质内过表达细胞模型,MTT法检测GA不同浓度及用药时程条件下的细胞活力,应用Western blot技术及共聚焦免疫荧光双标染色观察GA预处理后细胞内HSP70和α-syn的表达。荧光分光光度计测量各组细胞内蛋白酶体水解酶活性的变化。结果MTT示GA20～300nmol·L-1预处理使细胞活力呈浓度依赖性上升,吸光度分别上升至正常的65%、76%、85%和94%(鱼藤酮组为59%,P<0·01),而GA与鱼藤酮同时给药或作用于其后20h细胞活力无明显变化。Western blot结果提示GA预处理使HSP70表达上升至正常的3倍左右。共聚焦显微镜观察显示α-syn过表达现象得以抑制,并证实两者的共定位现象。酶活性测定提示GA预处理使类胰蛋白酶,类糜蛋白酶活性明显增强,荧光指数分别上升至10·4±1·61和96·0±4·77(鱼藤酮组为7·9±0·90和82·4±3·51,P<0·05),PgH水解酶活性也轻度上升。结论格尔德霉素可诱发热休克蛋白反应,主要通过HSP70的作用抑制α-syn的异常表达,促进泛素蛋白酶体降解功能,减轻蛋白水解应激反应,发挥神经保护效应。

3-硝基丙酸预处理对黑质多巴胺神经元能量代谢的影响

目的 观察 3 -硝基丙酸(3- nitropropionic acid,3 NP)预处理对黑质腺苷酸及腺苷含量的影响,探讨能量代谢及腺苷含量改变在3- NP预处理保护多巴胺(dopamine,DA)神经元中的作用。方法 64 只雄性 SD大鼠随机分为对照组、3 -NP组、PD组及3- NP预处理组。3 -NP预处理组于6 羟基多巴胺(6 -OHDA)损毁前 24 h经腹腔注射3 NP (按体重20 mg/kg),采用高效液相色谱法(HPLC)测定术后2 h和1、3、5 d时间点损毁侧黑质腺苷酸及腺苷含量。结果 3- NP组2 h,帕金森病(PD)组3、5 d及3- NP预处理组各时间点较对照组ATP含量明显降低,腺苷酸ADP、-AMP等增高(P<0 .05或P<0. 01),3- NP预处理组3、5 d较PD组同时间点相比ATP水平增高(P<0. 05);3- NP预处理组各时间点腺苷持续在较高水平,与PD组同时间点相比显著增高(P<0 .01)。结论 3 -NP轻度抑制氧化磷酸化使能量代谢水平降低,有利于细胞能量储备和增强对后续抑制的耐受能力。腺苷水平增高在3 NP预处理保护神经元过程中可能具有重要作用。

^(99m)Tc-Annexin V检测早期凋亡多巴胺能神经元的实验研究

目的研究放射性核素标记的膜联蛋白V(Annexin V)与凋亡的多巴胺能神经元的结合特性,探讨使用凋亡显像剂99mTc-Annexin V早期活体显像诊断帕金森病的可行性。方法采用不同浓度的1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)以诱导其凋亡(PC120~200μm/L,SH-SY5Y0~500μm/L),FITC-Annexin V及碘化吡啶(pro-pidiumiodide,PI)双染进行流式细胞仪凋亡检测。以99mTc-Annexin V与凋亡的细胞进行饱和结合实验及细胞摄取实验,研究凋亡细胞与Annexin V的亲和力及其摄取99mTc-Annexin V的动力学。结果MPP+可诱导PC12细胞及SH-SY5Y细胞发生凋亡,并有明显的量效关系。凋亡细胞可特异性与99mTc-Annexin V结合,亲和力可达(7.16±1.78)nmol/L,每个凋亡的多巴胺能神经元表面的结合位点可达到(179±33)f mol/106cells(PC12)及(220±26)f mol/106cells(SH-SY5Y),且神经元的凋亡水平与其膜结合的99mTc-Annexin V放射性强度有相关性(P<0.001)。结论凋亡的多巴胺能神经元与99mTc-Annexin V有高度亲和力,其所结合的99mTc-Annexin V放射性强度与细胞的凋亡水平相关,99mTc-Annexin V可用于检测多巴胺能神经元的早期凋亡。

脂多糖诱发大鼠黑质多巴胺能神经元变性

目的 :观察脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS)对黑质多巴胺 (DA)能神经元的毒性作用 ,探讨帕金森病 (PD)发病机制。方法 :脑立体定位注射LPS入大鼠脑黑质后 ,采用酪氨酸羟化酶 (Tyrosinehydroxylase,TH)免疫组织化学染色 ,观察不同剂量LPS和 5 μgLPS注射后不同时间点黑质DA能神经元的损伤状况。结果 :0 1～ 10 μgLPS注射后14d ,导致TH+ 细胞数下降分别为 5 %、15 %、2 0 %、4 5 %、96 %和 99% ;5 μgLPS注射后与对照组相比 ,TH+ 细胞数3d后开始下降 ,14d明显减少 ,仅为 5 % ,30d后基本消失。结论 :LPS能诱导黑质DA能神经元变性 ,呈剂量和时间依赖性。

3-硝基丙酸多次预处理抑制N-myc表达保护多巴胺能神经元

目的 研究 3 硝基丙酸 (3 NPA)多次预处理对多巴胺能神经元的保护及即早基因N myc在其中的作用。方法 选择C5 7BL小鼠 ,应用 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3,6 四氢吡啶 (1 methy 4 phenyl 1,2 ,3,6 tetrahydropyridine,MPTP)制造帕金森病小鼠模型 ,应用免疫组织化学方法观察 3 NPA单次与多次预处理后小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶 (TH)阳性细胞数量的改变 ;应用免疫组织化学及蛋白印迹 (WesternBlot)方法观察即早基因N myc在中脑黑质中的表达及蛋白水平的变化。 结果 3 NPA单次预处理后 ,中脑黑质酪氨酸羟化酶 (TH)阳性细胞数量由MPTP组的 2 7.3± 5 .6上升到 5 9.3± 11.2 (P <0 .0 5 ) ,而 3 NPA多次预处理后 ,阳性细胞数量上升至 88.6± 14 .8(P <0 .0 1) ,单次预处理与多次预处理也有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;在空白对照组 ,中脑黑质几乎看不见N myc阳性细胞 (4 .1± 0 .5 ) ,经MPTP处理后 ,N myc阳性细胞数量明显增加 (89.3± 12 .7,P <0 .0 1) ,蛋白水平增加 ;3 NPA单次预处理后 ,中脑黑质N myc阳性细胞数量与MPTP组比较无明显变化 (81.8± 13.6 ,P >0 .0 5 ) ;3 NPA多次预处理后 ,N myc阳性细胞数量明显减少 4 7.9± 11.8(P <0 .0 5 ) ,N myc蛋白水平也有相同的变化。 结论 3

S-甲基异硫脲对脂多糖诱导多巴胺能神经元变性的保护作用

目的 探讨诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)抑制剂S 甲基异硫脲 (S methylisourea ,SMT)对脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)诱导多巴胺 (DA)能神经元变性的保护作用及其机制。 方法 4 8只大鼠随机分成 4组(n =12 ) :磷酸缓冲液 (PBS)对照组、LPS组、生理盐水治疗对照组和SMT治疗组 ;此 4组又各分成 1,7d两个亚组。立体定向注射 5 μgLPS致大鼠脑黑质建立PD炎症模型 ,采用化学比色法检测 1d亚组黑质内NO释放量以及iNOS活性改变 ;RT PCR检测iNOSmRNA的表达 ;酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase ,TH)免疫组织化学染色观察 7d亚组黑质DA能神经元的损伤情况。结果 与PBS对照组相比 ,LPS注入黑质导致TH阳性细胞数下降至 35 % (P <0 .0 5 ) ;同时黑质内NO含量 ,iNOS活性及iNOSmRNA表达明显增高 ;SMT治疗组NO释放量 ,iN OS活性及iNOSmRNA表达显著降低 (P <0 .0 1) ;TH阳性细胞数亦明显增多 ,达 70 % (P <0 .0 5 ) ,生理盐水治疗组对此无明显改善。结论 iNOS上调是LPS诱导DA能神经元变性机制中重要的因素之一 。

黑质内注射脂多糖对不同年龄大鼠DA能神经元和小胶质细胞活性的影响

目的探讨青年和老年大鼠黑质DA能(DA)神经元对脂多糖(LPS)所诱导的损伤作用的敏感性差异和对小胶质细胞活性的影响。方法采用立体定向技术向大鼠单侧黑质内注入LPS建立PD大鼠模型;采用免疫组化法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞和OX6阳性小胶质细胞变化;采用Fluoro-Jade B染色法检测黑质的变性神经元。结果黑质内注射LPS后,老年组大鼠黑质区TH阳性神经元数量较青年组明显减少(P<0.01);老年组大鼠黑质区Fluoro-Jade B阳性神经元明显多于青年组(P<0.01);青年组大鼠黑质部位的OX6阳性小胶质细胞主要是处在激活期的;而老年组大鼠黑质部位的OX6阳性小胶质细胞主要是活化期的(阿米巴样或巨噬细胞样)。结论老年大鼠的黑质DA能神经元对于LPS所诱导的损伤作用较青年大鼠更为敏感。

帕金森病丘脑底核神经电生理学研究进展

在帕金森病状态下,中枢神经系统内存在的大量异常神经电活动,其扰乱了正常的生理性电活动,导致一系列相关症状的产生。其中基底神经节内丘脑底核的异常神经电活动在帕金森病的发生中起着重要作用,其核团内放电频率、放电模式、电振荡活动、内部网络结构的改变与帕金森病的运动症状及非运动症状的出现有着紧密的联系,而各种异常电活动的产生又有着各自不同的病理机制。该文对帕金森病状态下丘脑底核异常神经电活动、相关症状及形成机制中的研究进展作一综述。

ChREBP在糖尿病大鼠视网膜中的表达及作用机制研究

目的观察转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜组织中的表达变化,探索其在糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)中的作用分子机制。方法采用随机数字表法将40只雄性SD大鼠分为DM组和对照组,每组20只。DM组给予一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(streptozocin,STZ)(60 mg/kg)建立DM模型;对照组注射等量的柠檬酸盐缓冲液。造模后每月监测大鼠血糖变化,3月后麻醉处死。获取大鼠眼球行冰冻切片,分别利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和免疫荧光染色观察两组大鼠视网膜结构的病理变化并检测ChREBP在视网膜中的分布变化。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time-polymerase chain reaction,qPCR)及Western blot检测大鼠视网膜组织中ChREBP和其下游靶基因硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的表达变化。结果与对照组相比,DM组血糖浓度显著升高(P<0.05),同时生长缓慢,体质量偏低(P<0.05)。HE染色显示在3月时DM组已经出现DR早期的病理变化。免疫荧光染色显示ChREBP在DM组大鼠的视网膜组织中表达量较对照组增加,部分蛋白分布由胞质转移至胞核。qPCR检测显示DM组大鼠视网膜组织中ChREBP和TXNIP的mRNA表达水平较对照组显著升高(P均<0.05)。Western blot检测显示ChREBP蛋白表达水平较对照组表达显著增加(P<0.05)。结论在DM大鼠视网膜组织中,ChREBP的表达增加并出现核转移。ChREBP可能通过调节下游分子TXNIP的表达参与DR的发生发展。

体外诱导扩增大鼠树突状细胞及其特性鉴定

目的: 体外诱导和扩增大鼠骨髓树突状细胞 (DC)的方法, 并进行生物学特性鉴定。方法: 将大鼠骨髓细胞培养 48h后, 去除悬浮细胞, 加入IL- 4和GM- CSF培养 2wk。在光镜和透射电镜下观察培养的DC的形态学特征。应用流式细胞仪检测DC表面分子MHC-Ⅱ类分子、B7 -1、B7- 2的表达水平。将DC与同种异体T细胞混合培养, 采用MTT比色法测定不同细胞密度的DC刺激同种T细胞增殖的能力。结果: 培养的DC胞浆突起大而长, 呈树突状, 具有DC的典型形态。培养 2wk的DC表面MHC -Ⅱ类分子表达的阳性率为 74. 2%, B7- 1、B7 -2分别为 81%、76%。培养的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论: 将大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮的细胞, 加入IL -4和GM -CSF培养, 可获得足量、较高纯度的DC, 为研究DC的功能奠定了基础。

谷氨酸诱发培养的大鼠星形胶质细胞内钙升高的机制

目的 研究谷氨酸对纯化培养的大鼠星形胶质细胞的胞内钙信号的影响及受体作用机制。 方法 用显微荧光测量技术监测星形胶质细胞内钙信号的动态变化和谷氨酸对其的影响 ,观察阻断NMDA和 /或AMPA受体 ,谷氨酸对胞内钙信号影响的变化。 结果 谷氨酸明显升高胞内游离钙浓度 ,NMDA和AMPA受体拮抗剂、胞外钙离子浓度的降低及钙离子螯合剂均可不同程度地减弱其引发的胞内游离钙离子升高程度。 结论 谷氨酸通过多种途径影响星形胶质胞内钙信号 ,激活NMDA和AMPA受体是其中的重要机制之一。

左旋四氢巴马汀在脑缺血再灌注损伤中作用的实验研究

目的 :探讨左旋四氢巴马汀 (L tetrahydropalmatine,L THP)对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 :采用小鼠和大鼠脑缺血模型 ,并术前 30min分别腹腔内注射生理盐水 (10ml/kg)、L THP(5 ,10 ,2 0mg/kg)和尼莫地平(0 0 4mg/kg) ,观察小鼠存活时间、大鼠神经功能缺损评分、脑梗死范围、超氧化物歧化酶 (SOD)活性、丙二醛 (MDA)和一氧化氮 (NO)含量的改变。结果 :与生理盐水组比较 ,L THP组可显著延长脑缺血小鼠的存活时间 ,改善脑缺血2h再灌注不同时间大鼠的神经功能缺损 ,缩小脑梗死范围 ,增加SOD活性、降低MDA和NO含量 (P <0 0 5 ) ;10、2 0mg/kgL THP作用与尼莫地平差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论 :L THP可通过抗自由基与减轻NO介导的神经毒性机制发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

实验性重症肌无力大鼠模型的研究

目的 从丁(氏)双鳍电鳐的电器官分离乙酰胆碱受体(AChR)免疫大鼠,建立实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)动物模型。方法 参照徐浩鹏等方法从丁(氏)双鳍电鳐的电器官提取AChR蛋白,并采用Folin-酚试剂法及酶联免疫吸附法(ELISA)检测提取蛋白的含量及活性;以提取的蛋白主动免疫Lewis大鼠,每天观察其临床表现,并于免疫后7周进行低频重复电刺激、单纤维肌电图及血清中乙酰胆碱受体抗体(AchRAb)水平检测。结果 提取蛋白的含量为35.4 mg/mL,AChR提取物可与阳性血清中的AChRAb发生结合反应。免疫后1周左右,实验组有3只大鼠出现轻度肌无力症状,持续2～5 d自行缓解;免疫后5周左右实验组8只大鼠均表现出不同程度肌无力症状。实验组大鼠低频重复电刺激阳性率达75％,其衰减率明显高于对照组。实验组大鼠单肌纤维动作电位平均连续差(MCD)值与正常对照组比较明显延长(P<0.01),而福(氏)完全佐剂(CFA)对照组与正常对照组间MCD值差异无显著性。实验组大鼠AChRAb水平明显高于CFA对照组(P<0.01);实验组7只大鼠AChRAb的P/N值≥2.1,而CFA对照组P/N值均<1.4。 结论 从丁(氏)双鳍电鳐电器官提取的AChR蛋白成功地诱导成EAMG动物模型,可为进一步研究重症肌无力创造一定条件。

脂多糖注入黑质对大鼠黑质纹状体单胺类递质和行为的影响

目的 探讨脂多糖 (L ipopolysaccharide,L PS)对大鼠行为学和黑质纹状体单胺类递质的影响。方法 采用立体定位注射 5μg L PS入大鼠脑黑质 ,在不同时间点观察大鼠注射阿朴吗啡后的旋转行为学 ,及采用HPL C测定黑质纹状体单胺类递质的含量变化。结果 L PS注射后 14、2 1、3 0 d,大鼠出现向注射侧的旋转行为 ,在黑质和纹状体 ,DA及其代谢产物随时间改变呈不同程度下降 (P<0 .0 5) ,而 5-HT仅有短暂下降 ,NA无变化。结论 L PS注入黑质特异性损害 DA能神经元 ,可降低黑质纹状体 DA及其代谢产物含量 。

脑梗死患者的颈动脉超声与脑底动脉经颅多普勒对照研究

目的 :探讨颈动脉粥样硬化和脑底动脉狭窄与不同类型脑梗死的关系。方法 :采用彩色多普勒超声和经颅多普勒超声诊断仪对 12 8例急性动脉粥样硬化性血栓性脑梗死 (ABI组 )患者和 132例急性腔隙性脑梗死 (LI组 )患者的颈动脉和脑底动脉进行检测 ,比较 2组脑梗死患者颈动脉和脑底动脉粥样硬化性损伤的发生率。结果 :2组患者颈动脉粥样硬化的发生率均超过 4 0 % ,阳性率相近 ;但ABI组中出现各种类型的脑底动脉狭窄 6 3例(49 2 % ) ,而LI组仅 39例 (2 9.5 % ) ,2组差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :颅底动脉病变在ABI的发病过程中起重要作用。

TGF-β1基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的 研究转化生长因子 β1(TGF β1)基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响。 方法 将TGF β1基因导入体外培养的大鼠树突状细胞 ,经过G4 18筛选后 ,采用Westernblot和水貂肺上皮细胞 (Mv1)生长抑制试验 ,了解转染细胞TGF β1的表达及其生物学活性。通过混合淋巴细胞反应 ,观察转染的树突状细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果 TGF β1基因转染的树突状细胞可以分泌TGF β1,而且具有特异性抑制Mv1增长的生物学活性。在混合淋巴细胞反应中 ,TGF β1基因转染的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖有抑制作用 ,而空载体pcDNA3对照组与未转染组的树突状细胞具有强烈的激发T细胞增殖的能力。结论 利用构建的TGF β1表达质粒转染大鼠树突状细胞 ,转入的TGF β1基因可以在树突状细胞内稳定表达 。

重组乙酰胆碱受体α-亚单位融合蛋白诱导实验性自身免疫性重症肌无力

目的 探讨重组乙酰胆碱受体 (Ach R)的α-亚单位融合蛋白诱导实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的可行性 ,从而为重症肌无力的实验研究创造条件。方法 以重组 Ach R的α-亚单位融合蛋白主动免疫L ewis大鼠 ,末次免疫后观察临床表现 ,并进行低频重复电刺激、单纤维肌电图及血清乙酰胆碱受体抗体 (Ach Rab)滴度检测。结果 实验组 5只大鼠有临床症状者 4只 ,主要表现为摄食减少 ,活动减少 ,嘶咬无力且易疲劳 ,其中 1只有明显肌无力 ;实验组 5只大鼠有 3只低频重复电刺激衰减率 >10 % ,其中 1只衰减率 >2 0 % ;实验组大鼠 MCD值较正常组明显延长 (P<0 . 0 1) ,而 CFA对照组与正常组 MCD值无明显差异 (P>0 . 0 5) ;实验组 5只大鼠Ach Rab的 P/ N值 ,有 4只≥ 2 .1,1只介于 1.4和 2 .1之间。结论 以重组 Ach R的α-亚单位融合蛋白主动免疫L

慢性左旋多巴治疗对帕金森病大鼠行为及基底节Fos表达的影响

目的 :研究帕金森病大鼠左旋多巴诱导异动症模型的行为学特征及其基底节区神经元活性的变化。 方法 :帕金森病大鼠给予左旋多巴治疗 2 8d ,观察其行为学 ,并用免疫组织化学方法观察纹状体、苍白球区Fos表达情况。 结果 :慢性左旋多巴治疗后 ,帕金森病大鼠出现异常不自主运动 ,包括刻板运动和增加的对侧旋转行为。急性左旋多巴治疗帕金森病大鼠损毁侧尾壳核和苍白球区Fos表达均增加 ,慢性左旋多巴治疗与急性治疗组比较损毁侧尾壳核区Fos明显减少 ,而苍白球区表达增加。结论 :慢性间断性左旋多巴治疗诱导帕金森病大鼠异常不自主运动是帕金森病患者左旋多巴诱导异动症的啮齿类动物模型 ,纹状体苍白球神经元活性增强可能参与其发生机制。