大蒜新素预防和治疗鼠巨细胞病毒性肝炎的实验研究

目的 探讨大蒜新素在体内对鼠巨细胞病毒 (m urine cytom egalovirus,MCMV)感染小鼠的预防及治疗作用。方法 建立 BAL B/c小鼠 MCMV重组病毒 (插入 L ac Z基因 )性肝炎模型 ,采用 X- gal染色测定β- gal在肝、肾及肺组织中的表达。 70只雌性 BAL B/c小鼠随机分为大蒜新素预防 +治疗组 (n=2 0 ) ,大蒜新素治疗组(n=2 0 ) ,更昔洛韦治疗组〔6 0 m g/(kg· d) ,n=10〕,安慰剂组 (n=10 )及空白对照组 (n=10 )。其中前两组又各均分为低、高剂量组〔2 5 ,75 m g/(kg· d)〕,检测血浆丙氨酸转氨酶 (AL T)水平和评估肝组织组织学活动性指数(HAI) ,并用原位杂交法检测肝组织中 MCMV DNA水平。结果 大蒜新素预防 +治疗组及治疗组与安慰剂组相比较 ,AL T、肝脏 HAI评分及 MCMV DNA杂交的积分光密度均明显降低 (P<0 .0 5 ) ,与更昔洛韦治疗组相比无显著差异 ;大蒜新素预防用药及加大用药剂量并不能显著降低 AL T、肝脏 HAI评分及 MCMV DNA积分光密度水平。结论 大蒜新素能减轻 MCMV性肝炎模型鼠肝功能损害 ,改善肝脏病理变化和降低肝组织内病毒 DNA负荷量 ,其治疗效果与更昔洛韦无显著差异 ,大蒜新素预防用药及加大用药剂量不能增加其病毒抑制效应。

双黄连、鱼腥草注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的:探讨双黄连、鱼腥草在细胞水平对鼠肝炎病毒3型(murine hepatitis virus,MHV-3)是否具有抑制作用。方法:细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测双黄连、鱼腥草的抗MHV-3活性。结果:双黄连半数中毒质量浓度(TC50)为6 100μg.m l-1,抗MHV-3病毒的半数抑制质量浓度(IC50)为304.9μg.m l-1;鱼腥草的分别为500、22.06μg.m l-1。治疗指数(TI)双黄连为20.07,鱼腥草为22.67。两种中药成分对MHV-3病毒的抑制作用均存在明显的量效反应关系(P<0.01)。结论:双黄连、鱼腥草在细胞水平有显著的抗MHV-3作用。

大蒜新素注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的:探讨大蒜新素(allitridin)在细胞水平对鼠肝炎病毒3型(mice hepatitis virus,MHV-3)的抑制作用。方法:细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测大蒜新素的抗MHV-3活性,改变给药时间探索大蒜新素抗MHV-3作用环节。结果:大蒜新素半数中毒浓度(TC50)为75mg/L,抗MHV-3病毒的半数有效浓度(IC50)为2.7mg/L,治疗指数(TI)为27.78,大蒜新素对MHV-3病毒的抑制作用存在明显的量效反应关系(P<0.01),并且对MHV-3病毒有预防和中和作用(P<0.01)。结论:大蒜新素在L2细胞中对MHV-3病毒有明显的抑制作用,其作用机制是多途径的。

巨细胞病毒感染与细胞凋亡的研究进展

CMV病毒和细胞凋亡的关系相当复杂,有时表现为诱导凋亡作用,有时表现为抗凋亡作用。从病毒的角度看,病毒诱导小胶质细胞、巨噬细胞、造血干细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等发生凋亡,可干扰机体抗病毒免疫反应,使病毒不至于被机体免疫系统清除,对于病毒感染的有些宿主细胞,病毒则利用自身抗凋亡作用以利于在感染细胞内完成病毒的复制和生活周期。从宿主的角度出发,机体会调动全身和局部抗病毒免疫反应、宿主细胞会启动凋亡机制来清除病毒。

巨细胞病毒感染对Th1/Th2细胞分化特异性转录因子T-bet/GATA-3表达的影响

目的动态观测小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对小鼠Th1/Th2细胞特异性转录因子T_bet/GATA_3表达的影响。方法建立MCMV感染模型,20只模型鼠分别于接种MCMVSmith株后第3、5、7、14天各处死5只;另设20只正常小鼠作为对照。用蚀斑形成法测定脾组织病毒滴度;双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清Th1类细胞因子IFN_γ和Th2类细胞因子IL_10表达水平;Western_blot法检测脾组织转录因子T_bet/GATA_3表达强度。结果MCMV感染早期IFN_γ表达显著上升,在感染第3天达峰值,与正常对照组比较差异显著(P<0.01);随后迅速下降,在感染第14天左右基本降至基线水平。T_bet转录因子表达在感染3d后逐渐下降,第7～14天表达显著低于感染后第3天(P<0.01)。IL_10表达在MCMV感染第5天增高,随后下降;在感染第14天又升高,与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)。转录因子GATA_3表达水平在MCMV感染第7～14天显著高于感染后第3天(P<0.01)。小鼠脾组织病毒滴度在感染第5天出现第1次高峰,随后下降,在感染第14天又增高达到峰值。结论MCMV感染通过上调GATA_3转录因子和IL_10表达,下调T_bet转录因子和IFN_γ表达,导致Th1/Th2失衡,表现为Th2细胞优势应答状态,这可能是CMV感染致宿主特异性细胞免疫功能降低并逃避机体特异性细胞免疫攻击的原因之一。

用重组病毒株建立鼠巨细胞病毒性肝炎的实验模型

用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠巨细胞病毒 (murinecytomegalovirus ,mCMV)性肝炎模型。20只BALB/c甲基强的松龙免疫抑制小鼠 ,腹腔接种1×106PFU病毒悬液 ,动态观察血单个核细胞和组织中mCMV感染及肝组织病理变化。结果 :①mCMV感染小鼠血单个核细胞中X -gal染色阳性细胞在48h时开始出现 ,第3天有所减少 ,在第6天达到高峰;②肝、肺、肾组织病毒感染72h后可见 ,在第12天斑点数最多 ,以肝组织病毒感染多见;③肝组织病变在病毒感染后96h开始出现 ,在第12天达到高峰。提示 :利用重组mCMV建立的mCMV性肝炎小鼠模型 ,在感染后2周仍保持较高感染水平 ,为CMV的研究提供了一个良好的实验模型。

大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)诱导感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)凋亡的动态变化及凋亡调控基因bcl-2和fasmRNA表达的影响。方法用流式细胞术测定HELF在高、低感染复数(MOI分别为2.5、0.25)HCMV感染后1、12、24、36、48、72、96h凋亡细胞比率;大、中、小剂量大蒜新素(9、6和3μg/mL)处理正常的和感染的HELF细胞(MOI为2.5)后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新素处理感染细胞(MIO为0.25)72h后bcl-2和fasmRNA表达强度变化,并与正常细胞和感染细胞对比分析。结果正常细胞凋亡比率保持恒定低水平(凋亡率平均2.68%);低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐渐增多,凋亡率峰值分别达8.85%(96h)和25.63%(72h);各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加,呈剂量依赖性,峰值分别为4.88%、6.47%和8.35%;但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降,大剂量药物处理72h时效应最为明显,凋亡细胞比率由25.63%降至16.24%。正常细胞高表达bcl-2,低表达fas基因;感染HCMV后,bcl-2表达显著下调,fas表达明显增强;大蒜新素处理感染细胞后使bcl-2表达强度明显高于感染细胞,fas表达水平明显低于感染细胞,但仍未恢复到正常细胞水平。结论HCMV是HELF凋亡的强诱导剂;

巨细胞病毒对细胞周期的影响及其机制

HCMV感染对细胞周期有很大的影响 ,处于不同细胞周期的细胞感染 HCMV,皆可导致细胞周期的改变 ,在 G0期及 G1期感染 HCMV可导致细胞周期进展到了 G1/S限制点 ,在 S期细胞感染 HCMV可导致细胞周期受阻 ,细胞将不能进行有丝分裂。 HCMV影响细胞周期主要是其极早期蛋白 IE1- 72及 IE2 - 86的作用 ,以IE2 - 86为主 ,其机制包括 :使 Cyclin E的转录活性增加 ;把 Cdk2从细胞浆转移到细胞核 ;细胞核中 CKIs水平的下降。

胚胎和干细胞中的巨细胞病毒感染

人巨细胞病毒是一组广泛感染人群的双股DNA病毒,尤其是新生儿和免疫缺陷患者的重要致病原。近年来,已在胚胎和干细胞中发现人巨细胞病毒感染。有关研究表明,胚胎、神经干细胞及造血干细胞感染人巨细胞病毒后,对胚胎和干细胞的生长分化有很大的影响。

人巨细胞病毒主要即刻早期抗原的致病机制与治疗

在细胞和分子水平对人巨细胞病毒致病机制的研究发现,主要即刻早期抗原(major immediate early antigen,MIEA)可促进人巨细胞病毒自身的产毒复制、影响宿主细胞基因表达、改变细胞生长周期导致细胞增殖或凋亡,并引发一系列炎症反应,是人巨细胞病毒致病的重要因素。抑制MIEA表达和对抗其功能的治疗显示出潜在优越性和良好的临床应用前景。

HCMV免疫逃避分子机制研究进展

人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)可在体内长期持续潜伏存在 ,在免疫功能低下时又复燃。HCMV在与人类共进化的过程中 ,形成了多种分子机制逃避机体免疫系统的监视 ,从而在体内长期持续潜伏存在 。

大蒜新素治疗小鼠巨细胞病毒性心肌炎作用研究

目的探讨大蒜新素对小鼠巨细胞病毒(MCMV)性心肌炎治疗作用及其抗CMV机制。方法60只BALB/c小鼠随机分成大蒜新素治疗组(20只)、安慰剂组(20只)和正常对照组(20只)。大蒜新素治疗组接种MCMVK181后24h开始用大蒜新素一般剂量(25mg/kg)腹腔注射,每天1次,共14d;安慰剂组和正常对照组仅用等量生理盐水。各组分别于治疗后第3、5、7、14天各处死5只小鼠,观察小鼠心肌组织病理损害;用双抗体夹心ELISA法检测小鼠心肌组织细胞因子IFNγ表达水平;用RTPCR方法检测小鼠脾核转录因子TbetmRNA表达强度。结果MCMV感染下调小鼠TbetmRNA和TH1类细胞因子IFNγ的表达(P<0.01);大蒜新素能诱导MCMV性心肌炎模型小鼠转录因子TbetmRNA和细胞因子IFNγ的表达显著增加(P<0.01),并显著改善MCMV感染小鼠心肌组织病理损害(P<0.05)。结论大蒜新素通过上调转录因子TbetmRNA表达进而促进TH1类细胞因子IFNγ分泌,诱导和促进TH1优势应答反应,增强机体特异性细胞免疫功能而发挥抗MCMV作用。

小鼠巨细胞病毒感染神经干细胞的体外研究

目的研究小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSC)增殖和分化的影响,为研究先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常的机制奠定理论基础。方法体外分离、培养和鉴定BABL/c胎鼠NSC,用含LacZ报告基因的重组小鼠巨细胞病毒RM461感染NSC,X-gal染色监测感染过程,透射电镜观察超微结构改变,PCR检测受染细胞及培养上清中病毒DNA及观察培养上清接种到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞病变效应,了解RM461对NSC的感染情况。通过绘制生长曲线、流式细胞术检测分化细胞比率,研究RM461对NSC增殖和分化的影响。结果RM461感染NSC48h后细胞出现肿胀、体积增大、神经球边缘的细胞发生脱落和死亡,细胞形态的改变随感染复数(MOI)的增加而更加明显;X-gal染色,24h受染细胞即可出现阳性改变,48h达高峰;RM461感染72h时,受染细胞及培养上清中病毒DNA呈阳性,培养上清接种到MEF后可出现明显的细胞病变效应,电镜下受染细胞胞浆中存在病毒颗粒,细胞器肿胀明显;RM461可明显抑制NSC的增殖和分化,当MOI为1时,分化培养2d,感染组胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇酶(NSE)阳性细胞的比例分别为(37.4±1.6)%和(8.9±0.8)%,远较未感染组[分别为(50.3±1.8)%和(23.4±1.3)%]低(P<0.01),且GFAP和NSE阳性细胞比率随MOI的增加降低更加明显。结论RM461可感染体外培养的NSC,并能形成产毒性感染;RM461可明显抑制NSC细胞的增殖和分化并导致干细胞死亡,这可能与先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常有关。

小鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及其机制研究

目的探讨小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化的影响及其机制。方法体外分离、培养BABL／c胎鼠NSCs,利用NSCs向神经细胞分化模型,用感染复数(MOI)为1的含Lacz报告基因的重组MCMV毒株RM461进行感染,通过免疫组化、流式细胞术和RT-PCR检测MCMV感染后Nestin、GFAP和NSE阳性细胞比率及对神经干细胞分化相关信号分子Wnt-1和neurogenin 1(Ngn1)基因表达的影响。结果体外分离培养的NSCs,神经干细胞特异性标志Nestin表达强阳性,并可进一步分化为GFAP阳性的星形胶质细胞和NF-200、NSE阳性的神经元。当NSCs分化培养2 d,感染组和未感染组Nestin阳性细胞分别为(62．2±1．8)％和(37．2±2．4)％(t= 4．62,P<0．01),差异有统计学意义;而GFAP阳性细胞的比例分别为(37．4±1．6)％和(50．3±1．8)％(t=9．89,P<0．01),NSE阳性细胞的比例分别为(8．9±0．8)％和(23．4±1．3)％(t=5．09, P<0．01),差异均有统计学意义。感染组和未感染组Wnt-1基因的相对表达量分别为0．14±0．03和0．32±0．04(t=7．21,P<0．01),Ngn1基因的相对表达量分别为0．09±0．01和0．21±0．02(t= 10．73,P<0．01),差异均有统计学意义。结论(1)CMV可抑制NSCs分化,这可能是CMV致脑发育异常的重要机制;(2)CMV感染可抑制Wnt-1和Ngn-1的基因表达而影响NSCs分化,人为调控这两条通路可能为探寻防治CMV感染致脑发育异常的方法提供新策略。

鼠巨细胞病毒感染RAW264．7细胞的体外实验研究

目的体外观察鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）对鼠巨噬细胞株RAW264．7的感染特点及其对细胞增殖和凋亡的影响。方法分别以感染复数（muniplicity of infection，MOI）为1、0．1、0．01的MCMVSmith株感染RAW细胞，于感染后6、12、24、36、48、72、96和120h收集细胞和培养上清，光镜下观察细胞病变，透射电镜观察感染细胞内病毒颗粒和细胞超微结构变化；免疫细胞化学检测MCMV早期抗原（early antigen，EA）表达以及蚀斑形成实验监测病毒增殖情况；MTT法和流式细胞术分别评估感染细胞增殖与凋亡的改变，以MCMV敏感的鼠胚胎成纤维细胞为阳性对照。结果MCMV感染后24～48h可见RAW细胞肿胀和脱落，电镜显示RAW胞浆中存在完整的病毒颗粒且细胞器肿胀明显；病毒感染RAW细胞后6h（MOI=1和0．1）～12h（MOI=0．01）可见病毒EA的阳性表达；感染后24h培养上清中病毒滴度即明显上升，至96～120h达高峰；RAW细胞增殖在感染后72～120h受到明显抑制；当MOI=0．1时，感染后72～120h细胞死亡率明显增高，但凋亡率改变不显著。结论巨噬细胞株RAW264．7在体外对MCMV易感，较鼠胚胎成纤维细胞更快形成溶细胞性的产毒性感染；病毒可抑制细胞增殖但不影响细胞凋亡，为深入探讨CMV相关免疫学致病机制提供了一个良好的体外细胞模型。