CDC25B与恶性肿瘤研究进展

CDC25(A、B和C)是双特异性蛋白磷酸酶,在细胞周期中充当重要的角色。CDC25B是CDC25激酶家族的最重要成员,贯穿细胞周期的各阶段,在不同时期存在于细胞内不同的位置,其在细胞周期各期转换中起关键作用,在细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。肩负激活CDK1(cyclin dependent kinases-1)-cyclinB的重大责任,是早期有丝分裂的启动因子,同时也是卵母细胞恢复减数分裂的核心调控因子。CDC25B是磷酸化蛋白,其活性的调节是通过磷酸化和去磷酸化进行的,其编码基因定位于20p13,编码酪氨酸磷酸酶,已被认为是一种新的癌基因。过量CDC25B可促进肿瘤生长和细胞恶性转化。其基因过度表达可能发生在恶性肿瘤的早期阶段,进而引起CDC25B基因表达异常紊乱,发生肿瘤改变。CDC25B在多种肿瘤中如结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和非霍奇金氏淋巴瘤等均有过度表达,并且与患者预后相关,为恶性肿瘤预后不良的危险因素。CDC25B基因已成为恶性肿瘤治疗的新靶点,近年来已有研究并合成了CDC25B抑制剂,有望成为防治恶性肿瘤的可行途径之一。

饥饿诱导肿瘤细胞自噬对细胞周期的影响

背景与目的:无血清饥饿方法可以诱发细胞自噬,同时也可以引起细胞周期阻滞。虽然研究者们对细胞自噬与细胞周期已经进行了深入的研究,但是对于两者之间的关系还是知之甚少。本研究旨在通过研究细胞周期素(Cyclin)在饥饿诱导的细胞发生自噬时表达的变化,来探讨自噬对细胞周期的影响。方法:对照组:d-Hanks液代替培养基饥饿诱导处于对数生长期的HeLa细胞,收获饥饿0、3、6、12h的细胞。实验组:用d-Hanks液开始饥饿的同时加入3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA),收获饥饿0、3、6、12h的细胞,用流式细胞术和Western blot法检测细胞周期素和特异性标记自噬的兔抗人微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC-3)。结果:饥饿3h对照组HeLa细胞中有LC-3表达,并随饥饿时间延长而逐渐增加。Cyclin E、Cyclin D3在饥饿3h开始减少,在饥饿6h降低至最低水平,而Cyclin A、Cyclin B1在饥饿6h开始下降。实验组HeLa细胞在饥饿3h时LC-3的表达水平较低,随饥饿时间的延长LC-3表达基本不变化,Cyclin D3、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B1表达的下降速度也较对照组减慢。结论:自噬参与饥饿诱导的Cyclin降解的水解过程,Cyclin D3、Cyclin E水解比Cyclin A、Cyclin B1出现早,降解速度快。

紫杉醇诱导人类原代胃癌细胞凋亡及其与细胞周期关系的研究

目的探讨紫杉醇作用于人的胃癌实体瘤的机制,为紫杉醇应用于胃癌化疗提供相应的实验室依据。方法应用流式细胞术的AnnexinⅤ/PI技术检测紫杉醇诱导的37例人胃癌原代细胞凋亡;Sub-G1方法分析细胞周期及检测晚期凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;Confocal检测凋亡发生的形态。结果AnnexinⅤ/PI法和Sub-G1法均能检测到不同浓度紫杉醇在不同时间诱导的胃癌细胞凋亡,同一浓度在不同时间诱导的胃癌细胞凋亡与对照相比差异均有显著性意义(均P<0.01);周期分布图可发现紫杉醇作用12h出现明显的G1期细胞减少,而S和G2/M期细胞增多;25.50μg/ml药物作用12和24h琼脂糖凝胶电泳均可见典型的梯形改变;共聚焦显微成像可见紫杉醇诱导的人胃癌细胞的典型早期和晚期凋亡图像。结论紫杉醇能诱导人胃癌细胞凋亡可能是其对胃癌化疗有效的机制之一。

香烟烟雾提取物对人呼吸道上皮细胞DNA损伤和凋亡的影响

背景与目的:香烟烟雾可以致多种细胞发生DNA损伤已有报道证实。本研究旨在进一步阐明香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)作用于正常人类支气管上皮细胞系(normalhumanbronchialepithelialcells,NHBE)和肺腺癌细胞系SPC-A1后引起的DNA损伤和凋亡情况。方法:不同浓度的CSE作用于NHBE和SPC-A1细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测两种细胞活性。荧光标记的磷酸化H2AX组蛋白(γ-H2AX)抗体特异性标记细胞核内DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreaks,DSBs)处的γ-H2AX,然后用流式细胞仪定量检测并分析DNA损伤。用免疫印迹检测γ-H2AX表达。同时,亚G1峰法(SubG1peak)和AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双染色流式细胞术检测CSE诱导的细胞凋亡。用激光共聚焦显微镜观察细胞损伤和凋亡形态学变化。结果:MTT结果显示,随CSE浓度和作用时间增加,细胞活性均逐渐降低。CSE可引起细胞DNA双链断裂,γ-H2AX最大值在作用后4h左右,然后逐渐降低。DNA损伤后平均12h可以出现凋亡。另外,激光共聚焦显微镜观察到两种细胞内的γ-H2AX量在细胞受到CSE刺激后快速大量的积聚,呈现典型细胞损伤的形态学变化,较为明显的凋亡形态学特征4h后方可出现。结论:CSE能直接引起NHBE和SPC-A1细胞的DNA损伤和凋亡,且存在着浓度和时间依赖关系。

联合放/化疗对细胞周期特异性凋亡的影响

目的 以急性T淋巴细胞白血病细胞株MOLT 4为模型,探讨作用于细胞周期相同或不同时相的放疗/化疗药物联合应用时是否具有抗癌增效作用、引起细胞凋亡的周期时相性是否发生改变及对细胞周期检测点(ckeckpoint)的影响。方法 分别将作用于G1 期的X ray(10Gy)及药物金克(JinKe) (2.0g/L);S期的喜树碱(CPT) (0.25μmol/L)及阿糖胞苷(Ara C) (1.00μmol/L);G2 /M期的药物威猛(Vm 26) (0.5μg/mL)及长春花碱(Vinblastine, Vin) (0.05μg/mL)分别联合分组应用对其进行不同时间段的培养,采用流式细胞术中的API法对凋亡细胞进行定量并对凋亡细胞的周期时相性进行定位检测。结果 G1 期的药物JinKe和X ray(10Gy)联合应用时,具有协同作用,其作用点仍以G1 期细胞为主。S期的两种药物CPT和Ara C联合应用时,两者也具有协同作用,其细胞周期作用点仍以S期为主。作用于G2 /M期的两种药物VM 26和Vin联合应用时,两者还是具有协同作用,但其细胞周期作用点几乎发生在细胞周期的所有时相。作用于G1 期的药物JinKe和作用于S期的药物CPT联合应用, 具有增强效应, 联合应用时其细胞周期作用点以G1 期和S期细胞为主。作用于G1 期的药物金克和作用于G2 /M期的药物VM 26联合应用,两者具有增强效应。作用于G2

Camptothecin(CPT)和Cytosine arabinoside(Ara-C)联合应用对MOLT-4细胞株周期特异性凋亡的影响

目的 以急性T淋巴细胞白血病细胞株MOLT— 4为模型 ,探讨作用于同一细胞周期的化疗药物Camptothecin(CPT)和Cytosinearabinoside(Ara C)联合应用时是否具有抗癌增效作用、引起细胞凋亡的周期时相性是否发生改变及对细胞周期检测点 (ckeckpoint)的影响。 方法 喜树碱 (CPT) ( 0 .2 5 μmol/L) ,阿糖胞苷 (Ara C) ( 1.0 0 μmol/L) ,及喜树碱 (CPT) ( 0 .2 5 μmol/L) +阿糖胞苷 (Ara C) ( 1.0 0 μmol/L)二药共同诱导急性早幼粒白血病细胞株MOLT 4细胞 4h ,分别采用激光共聚焦显微镜 (Confocal)观察其细胞的形态变化 ,采用Sub G1法 ,API法及cyclins/DNA双参数法 ,运用流式细胞术分析凋亡、凋亡细胞的周期时相性及CyclinE的表达规律。以Westernblot印迹法检测Bcl 2蛋白的表达。结果 喜树碱和阿糖胞苷联合应用时 ,凋亡细胞的数目明显增加 ,二者具有协同效应。发生凋亡的细胞大多数仍然是S期细胞。CyclinE的表达升高 ,bcl 2蛋白的表达降低。结论 作用于同一细胞周期的化疗药物CPT和Ara C联合应用时 ,具有协同效应但并不改变细胞周期的作用点(Checkpoint)。CyclinE和Bcl 2蛋白似乎在药物作用时起着关键性的调节作用 ,并对检测点的敏感性产生重要影响。

紫杉醇诱导急性白血病细胞S期特异性凋亡

背景与目的:化疗药物的细胞周期特异性是临床设计化疗方案的重要依据。一般认为,紫杉醇为G2/M期特异性化疗药物。但是近来的相关研究却表明,药物在体内的细胞周期特异性可能与体外不同。本研究旨在观察紫杉醇作用于不同生长状态下白血病细胞的细胞周期特异性有无改变。方法:利用流式细胞分析技术,对紫杉醇作用于人急性淋巴细胞性白血病细胞株Molt-4以及作用于17例急性白血病细胞所诱导的凋亡效应进行了观察。结果:紫杉醇诱导在对数生长状态下的Molt-4细胞株G2/M期特异性凋亡,在高密度状态下培养的Molt-4细胞为G0/G1期特异性凋亡,而在临床标本中诱导S期特异性凋亡。结论:紫杉醇在不同模型诱导不同的细胞周期特异性凋亡。与一般认为的不同,紫杉醇引起患者白血病细胞S期特异性凋亡。这些不同很可能与细胞处于不同的生长状态有关。

体外Fas介导肿瘤细胞凋亡过程中cyclins/CDKs的变化规律及调节机制

目的:探讨Fas介导的细胞周期特异性细胞凋亡发生过程中,细胞周期蛋白(cyclins)和细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)的变化规律,及其可能的调节机制。方法:以急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞株为靶细胞,建立Fas介导的细胞周期特异性凋亡模型;采用cyclin/DNA双参数流式细胞术和Western印迹法检测cyclins的表达规律;应用Western印迹法检测CDK1的Thr-161、Tyr-15位点和CDK2的Thr-160位点磷酸化水平的变化。结果:重组人Fas配体(re-combinant human Fas ligand,rhFasL)诱导Molt-4细胞的凋亡定位在G1期。在发生细胞凋亡效应前,cyclin D3水平明显升高,而cyclin E水平和CDK2的Thr-160位点磷酸化水平均明显下降;发生凋亡效应后,cyclin D3水平明显下降,而cyclin E水平升高,CDK2的Thr-160位点磷酸化水平则明显下降,CDK1的Thr-161、Tyr-15位点磷酸化水平稍有下降。Cyclin A和Cyclin B1水平在诱导细胞凋亡过程中无明显变化。Roscovitine在特定浓度(5μmol/L)下可下调CDK2 Thr-160位点和CDK1 Thr-161位点的磷酸化水平,与rhFasL共同作用后细胞凋亡的发生率明显升高。结论:Fas介导的细胞凋亡具有细胞周期特异性,并始动于晚G1期,是G1期cyclin E/CDK2活性下降以及晚G1期检测点监督的结果;cyclin D3/CDK复合体可能是决定细胞凋亡能否发生的关键。

共转染CDK1、CDK2siRNA对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响

目的研究共转染CDK1、CDK2siRNA同时抑制CDKI、CDK2蛋白表达对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响，探讨细胞周期主要调控分子在肿瘤细胞凋亡中的作用。方法以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象，用脂质体lipofectamine2000同时转染CDKl和CDK2siRNA。在转染后48、60h收集细胞，用Western印迹检测CDKl、CDK2蛋白的表达，AnnexinV／PI检测转染细胞的凋亡，流式细胞术DNA含量检测分析细胞周期。转染细胞进行瑞氏一姬姆萨染色（Wright—Giemsa）后在显微镜下观察其形态变化i结果共转染CDKl、CDK2siRNA后48和60h，Western印迹结果显示CDKl和CDK2蛋白的表达都同时降低。共转染CDKl、CDK2siRNA后，细胞周期S期和G1／M期比例与对照相比有明显增加；共转染细胞经瑞氏一姬姆萨染色后在显微镜下可见双核或多核细胞增多；AnnexinV／PI检测结果显示共转染CDK1、CDK2siRNA的细胞在48和60h细胞凋亡率与对照相比有显著的升高。结论siRNA干扰导致的CDKI、CDK2表达同时降低不仅导致细胞周期s期和G1／M期的阻滞，也诱导了肿瘤细胞的凋亡。

流式细胞术的凋亡检测技术在人胃肠实体瘤药敏试验中的应用

目的化疗药能诱导肿瘤细胞凋亡,据此将流式细胞术的经典凋亡检测技术应用到临床特异性抗肿瘤药物的筛查,实现快速,准确的药物敏感性报告。方法应用流式细胞术的An- nexin V/PI技术,检测67例临床手术切除的胃肠肿瘤在不同化疗药物诱导下发生的凋亡。结果7种化疗药物诱导的胃肠肿瘤凋亡率有显著差异,胃癌的凋亡率以紫杉醇,丝裂霉素,氟尿嘧啶最高;而大肠癌以氟尿嘧啶,丝裂霉素,奥沙利铂诱导的凋亡率最高。联合化疗方案,胃癌以氟尿嘧啶联合紫杉醇的敏感率及凋亡率最高;大肠癌以氟尿嘧啶联合奥沙利铂的敏感率及凋亡率最高。结论不同肿瘤或同一肿瘤的不同个体,对化疗药物的敏感性均不同。临床可应用凋亡检测技术作为快速的药物敏感性检测方法,为肿瘤化疗筛选合适的个体化有效方案,避免无效化疗。

细胞增殖对DNA损伤敏感度的影响

目的观察细胞增殖状态对DNA损伤敏感度的影响。方法相同时间和强度的紫外线（UV）作用于过以及未经过植物血凝素（PHA）刺激的外周血淋巴细胞（PBLs），荧光标记的磷酸化H2AX组蛋白（γ-H2AX）抗体特异性标记细胞核内DNA双链断裂（DSBs）处的γ-H2AX，然后用流式细胞仪定量检测并分析DNA损伤，用Annexin V—FITC／PI检测细胞凋亡。结果经PHA刺激PBLs细胞进入增殖状态，UV可引起DNA双链断裂，增殖期的PBLs细胞DNA损伤程度明显大于静止期PBLs细胞。结论受到相同打击后，处于增殖期的淋巴细胞DNA损伤较静止期更为明显。

CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用

目的研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1（cyclin．dependent kinase1，CDK1）siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响，探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用，揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制。方法以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象，脂质体转染CDK1siRNA，转染后48h加紫杉醇（Tax01）（20μg／m1）刺激凋亡，Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达，AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡，流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期。结果转染CDK1 siRNA后，CDK1蛋白的表达下降，细胞周期G2／M期比例增加，细胞凋亡率与对照相比没有明显升高。只加Taxol刺激12h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2／M期比例增加。转染CDKlsiRNA后再用Taxol刺激，其细胞凋亡率没有明显改变，G2／M期阻滞效应也没有叠加。BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降，与CDK1表达减少没有相关性。结论siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2／M期阻滞，没有引起细胞凋亡；CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响。