RNAi介导Caspase-3基因及其抑制LPS诱导肾脏上皮细胞凋亡的研究

目的:探讨RNA干扰Caspase-3基因及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠Caspase-3基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-Caspase-3shRNA,用电穿孔法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达Caspase-3 shRNA的细胞系。实验分为3组:①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染Caspase-3 shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,以及各组Caspase-8蛋白的活性。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),Caspase-3的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P<0.01)。结论:针对Caspase-3的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。

半乳糖苷凝集素-7免疫增强功能的体外研究

目的了解半乳糖苷凝集素-7(galectin-7)对不同T细胞亚群增殖的影响,并进一步探讨其免疫治疗方面的应用前景。方法利用不同浓度的重组Galectin-7蛋白在有或无抗CD3和CD28抗体存在时与纯化的T细胞共同培养5 d,流式细胞仪检测T细胞及各亚群的增殖情况。结果 galectin-7能明显诱导T细胞的增殖,在与抗CD3和抗CD28抗体联用时能协同促进T细胞增殖反应,增殖的细胞主要为CD8+T细胞。结论 galectin-7能诱导并促进T细胞的增殖,在体外发挥免疫增强作用,深入探索其作用机制,有望研发新的靶点药物用于肿瘤的临床免疫治疗。

术前输注供者脾细胞联合应用西罗莫司延长小鼠移植心存活时间的机理

目的 探讨移植术前输注供者脾细胞（DST）联合应用西罗莫司（SRL）延长小鼠移植心存活时间的机理。方法 单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞及静脉输注的脾细胞均采用经丝裂霉素C处理后失去增殖活性的Balb／c（H-2^d）小鼠脾细胞（包括体外实验和体内实验）。（1）体外实验：分为3组，空白对照组：取正常C57BL／6（H-2^b）小鼠（136小鼠）的脾细胞作为反应细胞；SRL组：取用SRL（1．5μ·g^-1·d^-1）灌胃7d后的B6小鼠脾细胞作为反应细胞；DST＋SRL组：取行脾细胞静脉输注8d、次日予SRL（1．5μl·g^-1·d^-1）灌胃7d后的B6小鼠的脾细胞作为反应细胞。观察各组在单向混合培养中的脾细胞增殖能力。（2）体内实验：Balb／c小鼠为供者，B6小鼠为受者，建立颈部异位心脏移植模型。实验分为3组，空白对照组：单纯行心脏移植；DST组：受者移植前8d给予供者脾细胞静脉输注；DST＋SRL组：受者移植前8d给予供者脾细胞静脉输注，次日予以SRL灌胃7d（1．5μl·g^-1·d^-1）。术后观察各组移植心的存活时间、病理表现、受者淋巴细胞中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Tr细胞）和凋亡细胞比例的改变及同种抗原刺激后增殖活性变化。结果 体外实验中，DST＋SRL组反应细胞增殖活性平均为（13．76±2．81）％，明显低于空白对照组（28．14％±5．53％，P〈0．05）。体内实验中，空白对照组、DST＋SRL组以及DST组移植心平均存活时间分别为（8．6±0．48）d、（35±14．4）d和（4．83±0．52）d，DST＋SRL组存活时间显著延长（P〈0．05）；流式细胞术（FACS）分析显示DST＋SRL组脾细胞中CD4^＋CD25^＋Tr细胞比例平均为（3．39±0．21）％，明显高于空白对照组（1．57％±0．3％，P〈0．05）。结论移植术前输注供者脾细胞联合应用西罗莫司可通过清除同种反应性T细胞克隆，增加受者体内CD4^＋CD25^＋Tr细胞的比例，减低对同种抗原的应答能力，从而延长同种小鼠移植心存活时间。

输注调节性T细胞延缓非肥胖糖尿病小鼠糖尿病的发生

目的观察过继输注调节性T细胞（Treg）对非肥胖糖尿病（NOD）小鼠自发性糖尿病发生的影响。方法分选NOD小鼠天然调节性T细胞（nTreg），并诱导Naive T细胞转化为CD4^＋CD25^＋ Foxp3^＋调节性T细胞（iTreg），分别输注予4周龄的雌性NOD小鼠，观察糖尿病的发生情况，并确定细胞输注后Treg在体内的分布、检测血清中TGF-β1、IL-10及IL-4的表达以探讨Treg的作用机制。结果对照组小鼠13周龄时即100％自发性发生糖尿病，而输注iTreg和nTreg分别能延缓糖尿病的发生时间至24周龄和25周龄，与对照组比较差异有统计学意义（P〉0．05）。Treg细胞输注后主要分布在胸腺，iTreg在体内能促进TGF-β1、IL-10及IL-4表达的上调[血中浓度分别为（543．00±26．51）、（107．67±12．66）、（93．33±12．58）ng／L]，与对照组比较差异有统计学意义[（60．67±15．82）、（20．67±6．03）、（30．67±5．51）ng／L，P〈0．05]。结论在体外诱导生成的调节性T细胞可延缓NOD小鼠糖尿病的发生，其机制与上调具有免疫抑制效应的细胞因子相关。

转化生长因子-β1联合白细胞介素-2体外诱导非肥胖糖尿病小鼠调节性T细胞的产生

目的体外诱导非肥胖糖尿病（NOD）小鼠CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞（Treg）的产生并检测其免疫抑制功能。探讨外源性白细胞介素（IL）-2在诱导方案中的作用。方法分选NOD小鼠童贞T细胞（NmveT），利用Anti—CD3、Anti—CD28刺激，同时给予转化生长因子-β1（TGF—B1）和白细胞介素-2（IL-2），共同培养5d，收获诱导性Treg（iTreg），经流式细胞仪检测其表型。利用体外T细胞增殖体系，对比NOD小鼠天然Treg（nTreg），评价iTreg的免疫抑制能力。将诱导方案中的IL-2撤除以观察其作用。结果TGF-β1联合IL-2能诱导NOD小鼠NaiveT转化为iTreg，较对照组有统计学意义[（41．33±3．21）％比（8．00±3．00）％，P〈0．05]。iTreg可有效抑制T细胞增殖，其能力与nTreg的差异无统计学意义[（40．33±1．03）％比（38．33±3．06），P〉0．05]。外源性IL-2有利于iTreg的产生[（41．33±3．21）％比（15．00±1．00）％，P〈0．05]。结论TGF-β1联合IL-2可在体外诱导Naive T转化为具有免疫抑制功能的Treg。