结肠癌细胞凋亡与增殖的平衡及其与预后的关系

背景与目的:人体正常组织器官中,特定组织中凋亡与增殖细胞维持着动态平衡,一旦凋亡与增殖的平衡被打破,将导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生。我们通过研究结肠癌细胞和淋巴细胞演进过程中凋亡与增殖平衡机制的变化,及其与患者生存的关系,探讨结肠癌的发生、发展规律。方法:采用低分子量DNA抽提后荧光染料染色法(Sub G1法)和Ki-67/DNA双参数法,分别定量分析凋亡群体和增殖群体。应用激光共聚焦显微镜对组织细胞的增殖进行形态学观察,Kaplan-M eier法分析生存率。结果:对照组细胞、腺瘤细胞、肿瘤组Dukes蒺A期、B期、C+D期细胞中,凋亡指数/增殖指数(apoptosis index/proliferating index,AI/PI)分别为0.45±0.19、0.30±0.07、0.29±0.11、0.28±0.10和0.26±0.07。对照组的AI/PI大于其余4组(P<0.01)。在结肠癌细胞的大小、类型、分化程度、Dukes蒺分期和淋巴结转移等临床病理特征中,AI/PI总体呈下调的趋势。正常人和肿瘤患者外周血淋巴细胞AI/PI分别为0.49±0.12和0.64±0.11。肿瘤患者淋巴细胞的AI/PI大于对照组(P<0.01)。用激光共聚焦显微镜可观察到结肠对照组、腺瘤和肿瘤组织中Ki-67的表达。根据AI/PI的中位数值0.285,将结肠癌患者分为≥0.285组和<0.285组。经log-rank检验两组患者生存时间无显著性?

全反式维甲酸对HL-60细胞分化和凋亡的影响

背景与目的:用全反式维甲酸(alltransretinoidacid,ATRA)治疗早幼粒细胞性白血病(premyeloidleukemia,M3)在肿瘤治疗史上是一个重要里程碑。已有研究表明,ATRA治疗白血病的机理是诱导白血病细胞向成熟细胞方向分化,然而人们对分化的肿瘤细胞最终去向还不完全清楚。本实验进一步探讨ATRA诱导HL-60细胞分化和凋亡的关系。方法:以分化诱导剂ATRA(终浓度为10μmol/L)作用不同时间的HL-60细胞为检测对象,应用流式细胞仪分析细胞表面的分化标志物及细胞周期;经碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色后,激光共聚焦显微镜下对已分化细胞进行形态学确认;应用流式细胞仪检测药物诱导后不同时间点的细胞凋亡。结果:(1)随着药物诱导时间的延长,被诱导的HL-60细胞体积逐渐增大,在72h后,被诱导细胞开始表达分化标志物CD11b并出现细胞核型的变化;(2)在药物诱导96h后,细胞开始出现了凋亡峰,而在药物诱导72h后脱药培养8h,则可以出现高于96h的凋亡峰。结论:ATRA并不能诱导HL-60细胞完成终端分化,但是该药可以诱导白血病细胞向成熟方向分化,而且已分化的肿瘤细胞于发生凋亡。

细胞周期蛋白A、B1、D3、E在同步化及非同步化G_1期MOLT-4细胞中的表达

背景与目的我们已经利用流式细胞术(flowcytometry,FCM)的多参数分析方法证实,用“双thymidine阻滞”获得的同步化细胞,其细胞周期蛋(Cyclins)A、B1、D3、E的表达严重失衡。但是,由于当时技术条件的限制,不可能对同期同步和非同步化的细胞中CyclinsA、B1、D3、E进行对照研究。本研究目的是用新建立的分选后的免疫印迹法(postsortingWesternblot),比较CyclinsA、B1、D3、E在同期同步及非同步化G1期MOLT鄄4细胞中的表达,证实双thymidine阻滞法诱导细胞同步化用于分析正常细胞周期的不合理性。方法以MOLT鄄4细胞为模型,用双thymidine阻滞法将细胞同步在G1/S转换期起始处的G1期,应用流式细胞术分选出同期非同步化生长的G1期细胞,采用DNA/Cyclins双参数分析法及免疫印迹法(Westernblot),检测同期同步化及非同步化G1期细胞中CyclinsA、B1、D3、E的表达。结果在分选的非同步化的G1期细胞中CyclinsA、B1几乎不表达,而在同期同步化的G1期细胞中具有明显的表达,CyclinsD3、E在同步化的G1期细胞中的表达明显高于同期分选的非同步化的G1期细胞,利用FCM的多参数分析方法和免疫印迹法所获得的结果一致。结论用双thymidine阻滞干预方法获得的同步化细胞其CyclinsA、B1、D3、E并不能代表正常细胞内的表达水平。

中药金克通过G_1期阻滞和诱导凋亡抑制HL-60细胞增殖

目的研究中药金克对体外HL-60细胞系细胞周期调控方面的影响。方法使用MTT比色法检测HL-60细胞活力,使用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,使用Western blot检测细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结果金克能通过G1期阻滞和诱导凋亡使HL-60细胞活性降低。金克作用于HL-60细胞引起剂量和时间依赖性凋亡。金克阻滞HL-60细胞在G1期的原因是CDKI蛋白(p19INK4,p21Cip/waf1和p27Kip1)表达增高,同时CDK2,CDK4,CDK6,Cyclin D1和Cyclin E表达降低。金克也引起凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2和Caspase-3的表达。结论首次证明了金克通过G1期阻滞和诱导凋亡抑制HL-60细胞的增殖,这表明金克是一个细胞周期特异性的抗癌药物。

结直肠癌细胞主要Cyclins（D1、E、A、B1）表达类型与其生物学行为的关系

目的 观察人类主要细胞周期素（Cyclin D1、E、A、B1）在结直肠癌中非时相表达特征,探讨主要细胞周期素表达分型与结直肠癌生物学行为的关系.方法 用流式细胞术（FCM）双参数法半定量检测83例结直肠癌手术切除标本细胞中Cyclin D1、E、A、B1表达.根据不同Cyclin在细胞周期中的作用及其异常表达特征,将其表达分为不同类型及亚型结合临床病理学资料进行分析.结果 结直肠癌细胞Cyclin（D1、E、A、B1）异常表达大致可归为5种类型：Ⅰ型Cyclin（D1、E、A、B1）均高表达;Ⅱ型Cyclin D1低表达,Cyclin（E、A、B1）均不同形式高表达;Ⅲ型Cyclin D1不表达,Cyclin（E、A、B1）均不同形式高表达;Ⅳ型Cyclin D1不表达,Cyclin（E、A、B1）不同形式低表达;Ⅴ型Cyclin（D1、E、A、B1）均不表达;Ⅱ型→Ⅳ型根据不同周期内Cyclin的优势表达分为相应不同的亚型.a亚型：Cyclin（E、B1）表达为主;b亚型：Cyclin E表达为主;c亚型：Cyclin B1表达为主;d亚型：Cyclin（E、A、B1）表达为主.主要Cyclins表达类型与结直肠癌淋巴结转移率、转移程度、浸润程度明显相关（P＜0.01）.主要Cyclins表达类型Ⅰ→Ⅴ型结直肠癌淋巴结转移率、转移程度、浸润程度呈上升趋势.结直肠癌的生长方式和细胞分化程度与主要Cyclins表达类型的亚型明显相关（P＜0.01）.结论 主要Cyclins（D1、E、A、B1）表达类型与结直肠癌生物学行为有关,可以作为一种体现结直肠癌生物学行为较为客观的分类方法.

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术，将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中，并转化于大肠埃希菌DH5a；筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1，并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组，产生重组腺病毒载体；用lipofectamine将其转染HEK293细胞，包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP，酶切和序列测定鉴定；用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞，流式细胞术检测其感染效率，RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞；外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体，HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。