AF0.3启动子调控的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异杀伤作用

背景与目的:甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)启动子调控下的目的基因能在AFP阳性肝癌组织中特异性表达;嘌呤核苷磷酸化酶(Escherichiacolipurinenucleosidephosphorylase,PNP)/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside,MeP-dR)自杀基因系统具有强杀瘤效应。本研究旨在探讨AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法:构建甲胎蛋白启动子AF0.3调控下PNP基因表达载体pAF0.3/PNP,导入AFP阳性肝癌细胞HepG2和阴性的肝癌细胞株SMMC7721,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的HepG2/0.3-PNP及SMMC7721/0.3-PNP细胞。RT-PCR检测二者在细胞中的表达。台盼蓝拒染法检测细胞增殖效应,MTT法和流式细胞仪检测两株细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测PNP基因产物活性。结果:不论有氧还是缺氧条件,HepG2/0.3-PNP对MeP-dR均较为敏感,SMMC7721/0.3-PNP则对MeP-dR完全不敏感。在任何一种条件下,HepG2/AF0.3-PNP在混合细胞中比例达25%后,就可致明显旁观者效应;而在同样条件下,SMMC7721/0.3-PNP不导致明显的旁观者效应。HPLC结果显示,pAF0.3/PNP在HepG2细胞中可以将MeP-dR转化为6-MP,但其在SMMC7721中则不具有转化活性。结论:AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性HepG2细胞有较好的杀伤作用。

pcDNA3.0/PNP-CD和pcDNA3.0/PNP表达载体的克隆和表达

目的 :构建新型PNP/Mep dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法 :利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP CD ,将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3 0中 ,构建融合与单自杀基因表达载体pcDNA 3 0 /PNP CD和pcD NA 3 0 /PNP ;酶切、PCR及测序鉴定两重组体。结果 :成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论 :两个新型自杀基因表达载体 ,尤其是PNP CD融合自杀基因载体 ,是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。

PNP表达质粒的构建及鉴定

目的构建并鉴定一种新型的PNP自杀基因表达载体。方法将PNP基因插入到pcDNA3.0中,构建PNP基因表达载体pcDNA3.0/PNP;通过酶切、PCR及测序鉴定重组体。采用脂质体介导法将pcDNA3.0/PNP转染三种肿瘤细胞株,RTPCR检测PNP基因在各细胞株中的表达。结果目的片段均成功插入相应的载体中,CMV启动子调控下的PNP基因在不同的肿瘤细胞株中实现了表达。结论CMV启动子调控的PNP基因表达载体是肿瘤基因治疗中一种新型、高效的治疗载体。

两种甲胎蛋白启动子调控下PNP基因载体的克隆和表达差异性分析

目的:分别构建甲胎蛋白(α- fetoprotein,AFP)启动子AF 0 3和AFP杂合启动子[HRE]AF调控的 PNP基因表达载体,检测并分析两者的表达差异性。方法: 将AF 0 3和[HRE]AF启动子插入载体 pcDNA- 3 .0 中,构建肝癌特异表达载体pAF- 0. 3 和 p[HRE]AF;将 PNP基因分别插入 pAF -0 .3 和 p[HRE] AF中,构建两启动子调控的 PNP基因表达载体;通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两重组体转染不同细胞株,RT PCR检测 PNP基因在各细胞株中表达,分析两者表达的特点。结果: 两目的片段均正确插入相应载体,pAF- 0 3/PNP中的 PNP基因在 AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达,而p[HRE] AF/PNP 中的 PNP 基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了靶向性表达。结论: 两种 PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效、特异性的治疗载体。两者的成功构建为利用PNP/Mep -dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗奠定了坚实的基础。

源于新型PNP/Mep-dR系统的融合及单自杀基因载体的构建和表达检测

目的 构建源于PNP/Mep -dR系统的融合及单自杀基因表达载体并检测二者表达。方法 经DNA重组技术制备融合基因PNP -TK ,将其及PNP基因分别插入真核表达载体pcDNA3 0 ,构建两真核表达载体pcDNA3 0 /PNP -TK和pcDNA3 0 /PNP ;酶切、PCR及测序鉴定两重组体。结果 成功构建了两个新型自杀基因表达载体并在HepG2细胞株中检测到二者表达。结论 两个重组体 ,尤其是pcDNA3 0 /PNP -TK ,是肿瘤基因治疗中高效、广谱的理想载体。

肾上腺髓质素和内皮素-1在大鼠肝肺综合征发病机制中的作用

[目的]探讨肝肺综合征(HPS)的发病机制。[方法]采用胆总管结扎(CBDL)术制备大鼠HPS模型,观察肺组织肾上腺髓质素(ADM)、内皮素1(ET1)及其受体(ETRA和ETRB)的表达和分布。[结果]在大鼠HPS形成过程中,血浆和肺组织中ADM、ET1水平动态升高,且与肺泡动脉氧分压差(A aDO2)正相关;HPS大鼠肺组织中ADM、内皮素前体原(ppET1mRNA)的表达较假手术组明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。HPS大鼠肺血管ETRA的分布及染色强度与假手术组比较无明显变化,而ETRB在远端肺小动脉和小静脉内膜上表达明显增强。图像分析结果显示CBDL5周(w)组大鼠ETRA染色面积、平均积分光密度值与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05),而CBDL5w组大鼠ETRB染色面积和平均积分光密度值明显高于假手术组,差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]扩血管物质ADM和缩血管物质ET1的共同作用可能参与HPS的发生,肺组织中升高的ET1可能更多地通过与在肺血管表达增强的ETRB结合从而扩张肺血管。