成年大鼠心肌细胞分离方法的改良

背景:目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞,但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大,且多以单个细胞的急性分离为目的,仅适于进行电生理研究。目的:建立稳定的改良成年SD大鼠心肌细胞分离方法,使之适于进行原代培养和研究。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/09在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心完成。材料:8～10周龄雄性SD大鼠30只,由同济医学院实验动物中心提供,Ⅱ型胶原酶、蛋白酶和不含脂肪酸的牛血清白蛋白分别为美国Worthington公司、美国Sigma公司和德国Merck公司产品。方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,采用改良的Langendorff灌流装置行主动脉逆行灌注,无钙Krebs-Henseleit缓冲液(KH液)非循环灌流4min,0.6g/LWorthington2型胶原酶联合0.03g/L蛋白酶消化约15min,剪下心室组织于消化液和10g/L牛血清白蛋白的混合液中,剪碎后于37℃振摇孵育10min,200μm尼龙网过滤,500g离心1min,梯度复钙,自然沉降。主要观察指标:心肌细胞的形态、活力和产量。结果:复钙后的杆状存活心肌细胞得率为(73±5.6)%(n=30),其中90%以上的杆状心肌无明显搏动,横纹清晰。每只大鼠心脏的平均存活心肌细胞产量为(4.2±0.4)×106。结论:经过改良的Langendorff逆行主动脉灌流酶解法分离成年大鼠心肌细胞,可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞/分子生物学研究。

心型脂肪酸结合蛋白金标记免疫层析法的建立

目的建立胶体金免疫层析检测人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的方法。方法采用胶体金标记抗H-FABP单克隆抗体67D3,将其与生物素化的抗H-FABP单抗66E2包被于吸水纤维,将链霉亲合素结合于硝酸纤维素膜,制成免疫层析试条,依据试剂条上出现肉[可见的红色线条判定结果。用其检测93例发病6h内的胸痛患者血浆中的H-FABP,与心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)的检测结果比较,评价其诊断急性心肌梗死(AMI)的敏感性和特异性。结果金标记试条检测H-FABP的浓度低限值为16.8ng/ml,检测结果与ELISA方法比较符合率达96.9%,诊断发病3h内和6h内AMI的敏感性分别为64.29%和84.38%,高于cTnI(28.57%、53.13%)和CK-MB(21.43%、56.25%)(P<0.05),特异性无显著性差异。结论本法简便、快速、准确,可用于AMI早期筛查。

血浆心肌脂肪酸结合蛋白在急性胸痛患者诊断中的意义

目的探讨血浆心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在急性胸痛患者中的诊断价值。方法对93例胸痛发作6 h内的患者,采用夹心ELISA法检测血浆H-FABP水平,其中急性心肌梗死(AMI)32例、不稳定型心绞痛(UAP)24例、稳定型心绞痛(SAP)22例,非心源性胸痛(NCCP)15例,并选69例健康体检者为对照组。结果AMI组的H-FABP水平(78.58±52.2 ng/mL)最高,UAP组(12.57±5.80 ng/mL)次之,差异有统计学意义(P<0.01);SAP组(3.52±2.29 ng/mL)、NCCP组(4.09±4.18 ng/mL)与对照组(3.30±1.56 ng/mL)比较差异无统计学意义(P>0.05)。以16.8 ng/mL作为H-FABP诊断AMI的最佳临界值,其诊断AMI敏感性为84.4%,特异性为91.8%。结论血浆H-FABP水平可作为心肌坏死或损伤的早期判断指标,可为急性胸痛患者的诊断提供依据。

快速检测血浆心肌脂肪酸结合蛋白诊断老年早期急性心肌梗死

目的探讨快速检测血浆心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)诊断老年早期急性心肌梗死(AM I)的价值。方法采用免疫层析技术研制H-FABP快速检测试剂条,检测64例发病6 h内的老年胸痛患者的血浆标本,比较其与心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和肌红蛋白(MYO)诊断早期AM I的敏感性、特异性。结果快速检测H-FABP诊断AM I的敏感性(90.48%)显著高于cTnⅠ(57.29%)和CK-MB(57.29%)(P=0.016),与MYO(85.71%)比较差异无统计学意义;H-FABP的特异性(95.35%)高于MYO(60.47%)(P=0.014),与cTnⅠ(97.44%)、CK-MB(83.72%)比较差异无统计学意义。结论快速检测H-FABP对于早期AM I具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于老年早期AM I的筛选。

EPO对缺血/再灌注损伤大鼠心肌细胞Mfn2蛋白表达及心肌细胞凋亡的影响

目的观察重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)对缺血/再灌注损伤大鼠心肌细胞Mitofusin2(Mfn2)蛋白表达的影响及其抗心肌细胞凋亡的作用。方法选取成年SD大鼠35只,随机分为正常组(Normal),假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),缺血再灌注EPO治疗组(I/R+EPO)。各组分别于再灌注3h和24h后,剪取心脏缺血/再灌注损伤区域,用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,免疫组化法检测Mfn2蛋白的表达。结果再灌注3h和24h后,与正常组和假手术组相比,I/R组Mfn2蛋白的表达和心肌细胞凋亡均显著增加;与I/R组相比,I/R+EPO组Mfn2蛋白的表达和心肌细胞凋亡均显著降低。结论EPO可以下调缺血再灌注损伤后心肌细胞Mfn2蛋白的表达,抑制心肌细胞的凋亡。

运动治疗老年2型糖尿病合并高血压

目的 :观察老年 2型糖尿病合并 1级高血压患者在进行有规律的中等强度运动前后 2 4h动态血压、空腹血糖及胰岛素水平等项的变化。方法 :2 0例老年 2型糖尿病合并高血压患者在饮食和口服降糖药物治疗的同时 ,保持中等强度的运动疗法共 3个月 ,观察运动前后上述指标的变化。结果 :运动后全天收缩压均值、日间收缩压均值明显下降 (P <0 .0 5 ) ,舒张压无明显变化。空腹血糖及空腹胰岛素也明显下降 (P <0 .0 5 ) ,血脂无明显变化。结论 :运动疗法能明显降低老年 2型糖尿病患者的全天收缩压均值及日间收缩压均值 ,降低血压的机制可能与降低血糖及胰岛素水平 。

重组人促红细胞生成素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡与线粒体融合基因2表达的影响

目的探讨不同剂量重组人促红细胞生成素(rHu-EPO)对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和线粒体融合基因2(Mfn2蛋白)表达的影响。方法将64只成年SD大鼠随机分为模型组、大剂量治疗组(负荷量rHu-EPO5 000 U.kg-1+rHu-EPO 1500 U.kg-1术后第2,4,6天腹腔注射)、小剂量治疗组(负荷量rHu-EPO 5000 U.kg-1+rHu-EPO 750 U.kg-1术后第2,4,6天腹腔注射)和假手术组,每组16只。分别于术后24 h和2周采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡,免疫组织化学法检测Mfn2蛋白表达。结果术后24 h假手术组、模型组、大剂量治疗组、小剂量治疗组心肌细胞凋亡指数分别为0,(60.99±5.28),(36.97±2.68),(38.10±3.41);Mfn2蛋白免疫组化染色平均吸光度分别为(0.080 6±0.013 4),(0.295 2±0.024 9),(0.125 3±0.020 9),(0.120 2±0.0197)。术后2周假手术组、模型组、大剂量治疗组、小剂量治疗组凋亡指数分别为0,(50.08±8.00),(26.54±2.97),(24.16±3.74),Mfn2蛋白免疫组化染色平均吸光度分别为(0.095 3±0.007 3),(0.247 3±0.019 1),(0.146 1±0.012 6),(0.154 2±0.010 6)。与假手术组比较,模型组凋亡指数和Mfn2蛋白表达显著增加(均P<0.05);与模型组比较,大、小剂量治疗组凋亡指数和Mfn2蛋白表达显著减少(均P<0.05);大剂量治疗组与小剂量治疗组凋亡指数和Mfn2蛋白表达差异无统计学意义。结论心肌梗死后即刻给予负荷剂量rHu-EPO并术后减量维持治疗1周可显著降低Mfn2蛋白表达,减少心肌细胞凋亡;rHu-EPO大、小剂量维持给药对Mfn2蛋白表达的调控作用和抗凋亡作用均差异无统计学意义。

OxLDL诱导人血管内皮细胞及平滑肌细胞DNA加合物生成

目的探讨oxLDL参与动脉粥样硬化发生的可能机制。方法培养人血管内皮细胞及平滑肌细胞,以50μg/L oxLDL刺激24、48h后,收获细胞用于后续实验：①免疫组化染色检测DNA加合物εdA水平;②免疫组化方法检测细胞内4-HNE修饰蛋白;③western blot法检测细胞内4-HNE修饰蛋白水平。结果oxLDL刺激EC及SMC中DNA加合物εdA水平及4-HNE修饰蛋白水平均较未刺激细胞组明显升高。结果 oxLDL诱导的氧化应激、脂质过氧化反应及其继发的DNA损伤可能为oxLDL参与动脉粥样硬化发生的重要机制。

血脂康胶囊对高胆固醇血症的调脂作用

目的 :以国产辛伐他汀为对照 ,观察血脂康胶囊对高胆固醇血症患者调脂作用。方法 :65例患者随机分为两组 ,治疗组 3 4例 ,口服血脂康胶囊 1 .2g ,qn ,对照组 3 1例 ,每晚顿服辛伐他汀 1 0mg ,连续 4周。结果 :治疗 4周末治疗组和对照组总胆固醇 (TC)分别降低了 2 1 .8%和 2 1 .3 % ,低密度脂蛋白 (LDL Ch)分别降低了 2 8.2 %和 2 2 .7% ,高密度脂蛋白 (HDL Ch)分别上升了 6.2 %和 5.7% ,两组比较差异无显著性 (P >0 .0 5) ,三酰甘油 (TG)分别降低了 1 8.1 %和1 .6% (P <0 .0 1 )。血脂康和辛伐他汀降低TC的总有效率分别为 79.4%和 74.2 % ;升高HDL Ch分别为 2 3 .5% ,1 9.4% ;治疗组降低TG有效率 3 5.2 %。疗程中患者均能很好耐受 ,未见明显不良反应。结论 :两种药物均能显著降低高胆固醇血症患者TC和LDL Ch ,其作用相近 ;血脂康降TG作用稍优于辛伐他汀。

血浆脂联素和肿瘤坏死因子-α在2型糖尿病合并冠心病患者中的作用

目的 :探讨血浆脂联素 (adiponectin)和肿瘤坏死因子 α(TNF α)在 2型糖尿病合并冠心病病人中的作用。方法 :对 86例 2型糖尿病人 (其中冠心病人 5 3例 ,单纯糖尿病人 3 3例 )进行空腹血糖 (FPG)、血总胆固醇(TCH )、甘油三酯 (TG)、体重指数 (BMI)、胰岛素敏感指数 (ISI)、空腹胰岛素 (FINS)、血浆脂联素和TNF α的检测 ,并与对照组比较。结果 :2型糖尿病合并冠心病组FPG、FINS、TCH和TG明显高于单纯糖尿病组 (P <0 0 5 ) ,BMI与单纯糖尿病组无明显差异 (P >0 0 5 ) ,ISI明显低于单纯糖尿病组 (P <0 0 5 ) ,血浆TNF α浓度明显高于单纯糖尿病组 (P <0 0 1) ,血浆脂联素水平明显低于单纯糖尿病组 (P <0 0 1)。血浆脂联素水平与胰岛素敏感指数呈显著正相关 (P <0 0 5 ) ,血浆TNF α水平与胰岛素敏感指数呈显著负相关 (P <0 0 5 )。结论 :血浆脂联素在 2型糖尿病合并冠心病的发生中发挥保护性作用 ,而TNF

罗格列酮在Ⅱ型糖尿病中的应用

罗格列酮是一种新型胰岛素增敏药 ,通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(PPAR γ) ,提高胰岛素敏感性 ,缓解胰岛素抵抗 ,降低血糖。它能缓解脂代谢紊乱 ,对Ⅱ型糖尿病的血管并发症有防治作用。罗格列酮副作用较小 ,低血糖发生率低 ,对肝功能的影响较少。不论是单独使用还是与其他药物联合使用 ,均十分安全。

快速检测心肌脂肪酸结合蛋白诊断早期急性心肌梗死

目的探讨快速检测血浆心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在诊断早期急性心肌梗死(AMI)中的价值。方法比较H-FABP、cTnI、CK-MB和MYO四种物质定量检测诊断发病6h内AMI的敏感性、特异性和准确性;比较H-FABP快速检测试剂条定性检测结果与ELISA定量检测结果。结果H-FABP诊断发病3h和6h内AMI的敏感性显著高于cTnI和CK-MB,特异性相比,差异无显著性,诊断准确性显著高于cTnI、CK-MB和MYO。试剂条定性检测结果与ELISA比较符合率达96.9%。结论H-FABP定性检测试剂条可用于早期AMI筛选诊断。

国产醋酸奥曲肽与洛哌丁胺对比治疗盆腔放疗相关性腹泻

目的:了解国产醋酸奥曲肽(依普比善)及洛哌丁胺治疗Ⅱ、Ⅲ级以上盆腔放疗相关性急性腹泻的疗效及不良反应情况。方法:盆腔放疗过程中发生Ⅱ-Ⅲ级腹泻的59例患者列入本观察项目,26例患者接受洛派丁胺治疗(首次剂量4mg,每4h给予2mg口服),33例患者接受依普比善治疗(100μg,皮下注射,tid),连续治疗5d后判断疗效。结果:洛哌丁胺组腹泻完全缓解率为34.6%,依普比善组为66.7%,差异有显著性。是否需要输液治疗及停止放疗时间2组差异具有显著性,P<0.05。洛哌丁胺治疗无效改用依普比善的腹泻缓解率为70.6%,依普比善治疗失败后提高依普比善治疗剂量仍有45.4%的腹泻缓解率。结论:国产奥曲肽依普比善治疗放疗相关性急性腹泻有效率显著高于洛哌丁胺,可显著降低腹泻患者需要输液治疗的比率,并缩短因腹泻导致放疗中断的时间。对于腹泻程度较重患者,尽早使用依普比善或提高依普比善剂量是较为合理的选择。

冠心病患者心肌脂肪酸结合蛋白水平的变化及其临床意义

目的探讨冠心病患者血浆心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的水平变化及其临床意义。方法选择78例胸痛发作6小时内的冠心病患者,其中急性心肌梗死(AMI)32例、不稳定性心绞痛(UAP)24例、稳定性心绞痛(SAP)22例,并选69例健康体检者为对照组。采用夹心ELISA法检测H-FABP含量。结果AMI组的H-FABP水平(78.58ng/ml±52.2ng/ml)明显高于UAP组(12.57ng/ml±5.80ng/ml),P<0.01、SAP组(3.52ng/ml±2.29ng/ml)和对照组(3.30ng/ml±1.56ng/ml),P<0.01;UAP组的H-FABP水平明显高于SAP组和对照组,P<0.01;SAP组和对照组的H-FABP水平比较无差异(P>0.05)。结论血浆H-FABP水平可作为心肌坏死或损伤的早期判断指标,可为冠心病患者的危险分层及治疗提供依据。