细胞色素P450 4F2基因的克隆、突变、表达和纯化

目的构建人细胞色素P450 4F2基因野生型、V81G和V433M突变型表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化出CYP4F2蛋白。方法用RT-PCR方法从人肾脏总RNA中逆转录扩增CYP4F2,将其插入克隆载体pMD18-T Simple Vector中,将测序鉴正确的CYP4F2基因N、C端改造,克隆构建重组表达载体pCWori+-CYP4F2(His)_4-WT。同时采用重叠PCR定点突变法构建pCWori +-CYP4F2 V81G(His)_4和pCWori+-CYP4F2 V433M(His)_4表达载体,分别转化至E.Coli XL-Blue中表达。结果经IPTG诱导可有效表达CYP4F2和突变体V81G与V433M,经Western blot分析可以观察到分子量为57 kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与His-Probe多克隆抗体起特异反应。用His- bind亲和层析纯化得到了纯度较高的His融合蛋白。结论用基因工程技术在大肠杆菌中有效表达人CYP4F2基因野生型、V81G和V433M突变型蛋白、并得到了纯度较高的CYP4F2蛋白,为进一步研究其生物学功能及研制相应抗体奠定了基础。

人细胞色素P450 4A11基因核心启动子区的鉴定

目的研究细胞色素P450 4A11基因启动子区对该基因转录活性的影响。方法运用生物信息学的方法预测细胞色素P450 4A11基因启动子区的重要调控序列,然后采用5’侧翼区缺失的方法将包含重要调控序列的启动子克隆到双报告基因载体中,用脂质体转染HepG2细胞,24h后检测荧光素酶相对活性。然后使用Alibaba2.0 Transfac4.0预测增强子区域可能存在的转录因子结合位点。结果·36～-720～+1、-972～+1、-1039～+1区域的启动子活性较高,其中-972～+1区域最强,与此相比-536～+1、-720～+1荧光素酶相对活性分别下降了96.9%和70.1%。结论人CYP4A11基因5’侧翼区的影响转录活性的启动子关键区域位于-972～-720bp范围内。