ZW10相互作用着丝粒蛋白对神经母细胞瘤增殖的影响及机制研究

目的:探讨ZW10相互作用着丝粒蛋白(ZW10 interacting kinetochore protein,ZWINT)对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞增殖的影响及作用机制。方法:利用NB数据集分析ZWINT表达水平与NB预后及临床分期的关系。EdU实验、流式细胞术和γH2AX免疫荧光染色分别检测干扰ZWINT表达对NB细胞增殖、周期分布和DNA损伤修复能力的影响。免疫组织化学/蛋白质印记(Western blot)检测MYCN扩增和无扩增组织及细胞系中ZWINT的表达情况。荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测干扰/过表达MYCN对ZWINT表达的影响。在线预测ZWINT的启动子区域MYCN的结合位点,ChIP-PCR和荧光素酶实验验证MYCN靶向调控ZWINT表达。强力霉素诱导Tet-on MYCN SH-SY-5Y细胞过表达MYCN同时干扰ZWINT表达,检测ZWINT对MYCN介导的细胞增殖、周期和DNA损伤修复功能的影响。结果:ZWINT表达水平与NB患儿总生存率、无事件生存率呈负相关,其表达随NB分期升高而增高。ZWINT干扰组NB细胞增殖明显减少,G_(2)/M期细胞比例显著增高,γH2AX焦点的形成增加。ZWINT在MYCN扩增的NB组织/细胞系中表达水平显著高于无扩增组。MYCN与ZWINT启动子区结合,干扰ZWINT表达可显著抑制MYCN对增殖的促进作用。结论:ZWINT是NB的不良预后指标,其表达受MYCN调控,干扰ZWINT表达导致MYCN扩增的NB细胞周期阻滞在G2/M期,DNA损伤修复增加,抑制NB细胞的增殖。

儿童恶性血液病并发血流感染病原学与临床特征

目的 探讨儿童恶性血液病血流感染的临床特点、病原学特征、细菌的耐药性及炎症指标变化,为预防及治疗血流感染提供依据。方法 回顾性分析2020年6月-2022年6月武汉儿童医院97例血流感染恶性血液病患儿的临床资料、实验室检测结果以及病原菌分布和药物敏感性数据。结果 女童38例,男童59例,年龄分布4个月~15岁;42.27%为急性淋巴细胞白血病,29.90%为急性髓系白血病;70.10%患儿处于粒缺状态,73.20%患儿有留置中心静脉管;革兰阳性菌感染占53.40%,以凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和链球菌属为主;肠杆菌目细菌中头孢曲松的耐药率为55.00%,阿米卡星及替加环素100.00%敏感,其中9株大肠埃希菌对碳青霉烯类的抗菌药物均敏感,13例肺炎克雷伯菌感染患儿中,耐碳青霉烯类抗菌药物菌株有2例。革兰阳性菌中凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌属和金黄色葡萄球菌对万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁的敏感率均为100.00%,凝固酶阴性葡萄球菌对青霉素、红霉素、苯唑西林耐药率分别为90.91%、86.36%和90.91%,草绿色链球菌中青霉素耐药率33.33%;革兰阴性菌组血流感染患儿血清降钙素原(PCT)和白细胞介素-6(IL-6)水平高于革兰阳性菌感染组(P<0.05)。结论 凝固酶阴性葡萄球菌,肠杆菌目及草绿色链球菌为恶性血液病儿童血流感染常见菌,病原菌药敏结果发布前使用利奈唑胺、万古霉素及碳青霉烯类抗菌药物可用于抗血流感染经验性预防用药;临床需加强患儿皮肤黏膜护理及集束化导管护理措施,有利于降低血流感染的发生。

基于多数据库分析FAM50A在肝细胞癌中的临床意义及生物学功能

目的分析50序列相似的家庭成员A(FAM50A)在肝细胞癌(HCC)中的临床意义及生物学功能,并探索其在HCC发生发展中的作用。方法分别采用Real-time PCR和Western blot检测FAM50A在45例HCC组织及配对癌旁组织中的表达水平。采用HPA数据库分析FAM50A的表达及定位。Oncomine数据库和GEPIA数据库分析FAM50A在HCC组织及正常肝组织中的表达差异。从癌症基因图谱数据库获取HCC临床病例资料,统计分析FAM50A表达量与HCC患者临床病理特征的关系。Kaplan Meier Plotter数据库分析FAM50A表达水平与HCC患者预后的关系,MethHC数据库分析FAM50A启动子区甲基化水平,String数据库分析FAM50A的蛋白相互作用网络,基因集富集分析(GSEA)数据库预测FAM50A在HCC中调控的可能信号通路。结果正常组织中,FAM50A mRNA在骨骼肌组织中表达量最高,肝脏组织居第37位。肿瘤组织中,其在卵巢癌组织中表达量最高,在HCC中表达量居第9位。FAM50A在正常肝组织中主要定位在细胞质、细胞膜及细胞核,在HCC组织中定位在细胞核。Real-time PCR检测结果显示FAM50A在HCC组织中的mRNA表达量高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001)。Western blot显示FAM50A蛋白在HCC组织中的表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Oncomine及GEPIA数据结果均显示FAM50A在HCC组织中的mRNA表达量高于正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05)。FAM50A基因mRNA表达量与HCC患者的性别(P=0.006)、肝硬化(P=0.001)、脉管癌栓(P=0.010)相关;与年龄、甲胎蛋白水平、肿瘤大小、分化程度、病理分期及是否远处转移无关(P>0.05)。与FAM50A低表达组患者相比,FAM50A高表达组患者总体死亡率较高、预后较差,差异有统计学意义(P<0.000 1),表现为癌基因特性。与正常肝组织相比,HCC组织FAM50A启动子区甲基化水平降低,差异有统计学意义(P<0.005)。与FAM50A相互作用的蛋白有SF3B3、ATP6AP1、NSFL1C等。FAM50A mRNA高表达样本富集到MAPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路等相关基因集(P<0.05)。结论 FAM50A在HCC中高表达,且FAM50A表达水平与HCC恶性程度及不良预后相关,可能作为癌基因在HCC中发挥作用。FAM50A有望成为HCC诊断及预后评估的新靶点。

高危型HPV16 E6蛋白通过活性氧途径介导宫颈癌细胞增殖的研究

目的探讨高危型人类乳头瘤病毒(HPV)16 E6蛋白促进宫颈癌细胞增殖的潜在作用机制,为降低宫颈癌患者对顺铂耐药性提供新的重要指导。方法将宫颈癌C33A(HPV-)空载细胞作为对照组,高危型HPV16 E6过表达C33A-E6细胞作为实验组。采用细胞计数盒8(CCK8)法观察高危型HPV16 E6蛋白对C33A空载/E6过表达2组细胞增殖的影响;流式细胞仪检测高危型HPV16 E6蛋白对C33A空载/E6过表达2组细胞内活性氧(ROS)水平及细胞凋亡的影响;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测顺铂对C33A空载/E6过表达2组细胞的生长抑制状况及其半抑制浓度(IC_(50));流式细胞仪检测5 mmol/L ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)/IC_(50)顺铂分别处理C33A空载/E6过表达2组细胞后,细胞内ROS水平及细胞凋亡状况;CCK8法评估NAC/顺铂对细胞增殖的影响。结果与C33A空载细胞相比,C33A-E6过表达细胞光密度D(450 nm)增长更明显,36 h时,C33A空载细胞D(450 nm)为1.87±0.12,C33A-E6过表达细胞D(450 nm)为2.67±0.17,差异有统计学意义,F=15.04,P<0.0001;C33A-E6过表达的细胞内ROS含量也由C33A空载组的(3.87±0.35)%上升为C33A-E6过表达组的(14.16±2.72)%,差异有统计学意义,χ^(2)=10.59,P=0.009;NAC处理细胞24 h后,2组细胞内ROS水平分别降至(0.65±0.12)%和(0.93±0.25)%,差异无统计学意义,χ^(2)=0.194,P=0.864;细胞增殖能力较未加入NAC处理组细胞均有下降,差异有统计学意义,F=42.50,P<0.001。C33A空载细胞凋亡率为(6.43±2.17)%,C33A-E6过表达细胞凋亡率为(5.82±1.68)%,差异无统计学意义,χ^(2)=1.326,P=0.314;但使用NAC抑制剂后可降低细胞的凋亡水平,C33A空载组由(7.35±2.11)%下降为(4.07±1.28)%,C33A-E6过表达组由(5.77±1.13)%下降为(1.88±0.52)%,差异有统计学意义,χ^(2)=5.427,P=0.008。MTT实验显示,2组细胞对顺铂的敏感度不同,C33A空载和C33A-E6过表达细胞的IC_(50)分别为4.726和3.481 mg/L,顺铂可促进2组细胞内ROS的生成(χ^(2)=4.864,P=0.013),抑制细胞增殖,F=170.7,P<0.001。结论高危型HPV16 E6蛋白可显著促进C33A宫颈癌细胞增殖,其机制可能与高危型HPV16 E6蛋白激活ROS的生产密切相关,升高宫颈癌细胞内ROS水平可成为治疗宫颈癌的一个潜在方法。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9在幽门螺杆菌感染导致炎症反应中的作用机制

目的探究前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)在幽门螺杆菌(H.pylori)感染导致炎症反应中的作用机制。方法收集2020年5月1日至2021年1月31日初次就诊于十堰市太和医院消化内科的60例胃炎患者(H.pylori阳性和阴性患者各30例)与30例健康体检者,检测其血清PCSK9水平。选取H.pylori标准菌株、4种H.pylori临床分离菌株、正常胃上皮细胞系GES-1与THP-1细胞经诱导形成的巨噬细胞。将H.pylori菌株与胃上皮细胞系GES-1共培养以制备不同上清液培养基,设立磷酸盐缓冲液空培养基即阴性对照培养基(阴性对照组)、H.pylori与GES-1细胞共培养上清液培养基(H.pylori感染GES-1组)、正常GES-1细胞上清液培养基(H.pylori未感染GES-1组)、H.pylori与GES-1细胞共培养上清液+PCSK9中和抗体培养基(抗PCSK9组)、H.pylori与GES-1细胞共培养上清液+人免疫球蛋白G2培养基(同型对照组)。采用Transwell迁移实验、实时荧光定量聚合酶链反应、平板集落形成实验、H.pylori吞噬溶酶体共定位实验等比较H.pylori感染GES-1组、H.pylori未感染GES-1组和阴性对照组,以及抗PCSK9组和同型对照组的巨噬细胞迁移数、CC趋化因子受体(CCR2)mRNA相对表达水平、白细胞介素(IL)-6和细胞坏死因子(TNF)-α释放水平、CD8^(+)T细胞胞膜磷酸化水平、巨噬细胞菌落数,分析PCSK9对H.pylori感染导致炎症反应的调控机制。统计学方法采用独立样本t检验。结果H.pylori阳性胃炎患者的血清PCSK9水平高于H.pylori阴性胃炎患者和健康体检者[(384.00±57.57)μg/L比(208.80±48.89)、(176.10±47.14)μg/L],差异均有统计学意义(t=12.71、15.31,均P<0.001)。与阴性对照培养基相比,H.pylori标准菌株和4种分离菌株均可诱导正常胃上皮细胞系GES-1分泌PCSK9[(1267.00±287.50]g/L比(2717.00±199.20)、(4858.00±302.40)、(3167.00±334.20)、(6075.00±597.30)、(4283.00±331.20)g/L],差异均有统计学意义(t=10.15、21.09、10.56、17.77、16.85,均P<0.001)。H.pylori感染GES-1组的巨噬细胞迁移数、巨噬细胞CCR2 mRNA相对表达水平、IL-6水平、TNF-α水平和巨噬细胞菌落数均高于H.pylori未感染GES-1组和阴性对照组[132.20±5.67比84.83±4.62、39.83±4.12,8.66±0.94比6.52±0.47、1.00±0.09,(281.00±8.56)ng/L比(115.00±7.72)、(64.00±5.44)ng/L,(619.80±18.47)ng/L比(373.30±12.85)、(225.70±6.44)ng/L,(357.00±16.31)菌落形成单位(CFU)比(134.80±8.64)、(74.17±9.68)CFU],差异均有统计学意义(t=15.85、32.27,4.96、19.79,35.28、52.43,26.84、49.37,29.49、36.53;均P<0.001)。H.pylori感染GES-1组的H.pylori吞噬溶酶体共定位百分比,以及CD8^(+)T细胞胞膜CD3ζ^(Tyr142)、杀伤分子颗粒酶B和穿孔素表达水平均低于H.pylori未感染组和阴性对照组[(15.33±1.86)%比(34.50±3.72)%、(65.67±3.56)%,464.20±120.80比1924.00±262.10、2390.00±484.10,(6.41±0.42)%比(17.37±0.73)%、(26.60±1.57)%,(6.84±1.37)%比(14.53±0.48)%、(26.22±1.21)%],差异均有统计学意义(t=11.27、30.70,12.39、9.45,30.50、31.90,25.96、13.00;均P<0.001)。抗PCSK9组的巨噬细胞迁移数、CCR2 mRNA相对表达水平、IL-6水平、TNF-α水平和巨噬细胞内菌落数均低于同型对照组[72.50±4.97比128.30±6.74、0.82±0.06比1.00±0.08、(85.50±4.37)ng/L比(277.70±8.98)ng/L、(291.80±13.69)ng/L比(615.30±12.65)ng/L、(111.50±10.21)CFU比(346.20±18.04)CFU],差异均有统计学意义(t=16.33、4.40、47.13、42.50、27.73,均P<0.001)。抗PCSK9组的H.pylori吞噬溶酶体共定位百分比,以及CD3ζ^(Tyr142)、杀伤分子颗粒酶B和穿孔素的表达水平均高于同型对照组[(51.05±3.03)%比(16.71±1.91)%、2948.00±384.00比1156.00±178.60、(53.88±3.86)%比(5.88±0.93)%、(32.80±2.07)%比(6.83±0.54)%],差异均有统计学意义(t=23.49、10.36、29.60、29.76,均P<0.001)。结论H.pylori通过诱导胃上皮细胞释放PCSK9抑制CD8^(+)T活化和细胞毒作用,还可招募巨噬细胞,激活核因子κB信号轴上调巨噬细胞炎症因子释放水平,抑制巨噬细胞的吞噬杀伤作用,调控炎症反应。

先天性糖基化病COG5-CDG患者1例的临床及遗传学分析

患者男,3岁8个月,面容异常,眼距过宽、鼻梁扁平,叫之反应差,语言运动发育落后,双手持握不协调,手指弯曲不能伸直。患者先天性近视,眼球震颤;牙齿易脱落。生殖系统异常表现为小阴茎及睾丸偏小。实验室生化检测肝肾功能未见明显异常,血清免疫球蛋白水平未见异常。脊柱X线片提示脊柱侧弯。头颅MRI提示小脑发育不良。高通量检测及Sanger测序验证发现患者COG5基因存在复合杂合变异,分别为遗传自母亲的c.1039C>T变异以及遗传自父亲的c.928+3A>G剪接位点变异;结合患者临床表型,患儿诊断为COG5基因异常所致的先天性糖基化病(COG5-CDG)。明确诊断以后,患者进行语言及运动相关的康复训练治疗,但治疗效果不明显。本研究报道了COG5-CDG并发现了2个COG5基因新变异,扩展了该基因的突变谱。