小鼠附睾小体特异性mRNA传递入N2a和TM4细胞的研究

目的:研究小鼠附睾小体特异性mRNA能否递入Neuro-2a(N2a)及TM4细胞中,为探讨附睾小体mRNA功能提供实验依据。方法:通过RT-PCR检测附睾特异性基因(Adam7、Crisp1、Defb22、Wfdc2、Wfdc9)在成年雄性BALB/c小鼠睾丸、附睾、附睾小体和精子中,以及在人睾丸、精浆小体和精子中的存在情况。通过低速离心、过滤、超速离心方法分离BALB/c小鼠附睾小体,通过PKH26进行荧光标记,与饥饿培养24 h的N2a和TM4细胞共孵育1 h,分别以未标记PKH26的附睾小体组、无附睾小体的加PKH26染料组、未加附睾小体和PKH26染料阴性组作为对照,观察附睾小体是否与N2a和TM4细胞融合并被摄取。通过RT-PCR对共孵育1 h后N2a和TM4细胞进行附睾特异性基因的检测。结果:Adam7和Crisp1在小鼠附睾、附睾小体和精子中存在,睾丸中无表达,在人精浆小体和精子中存在,睾丸中无表达。PKH26和hoechst33258荧光双标结果显示小鼠附睾小体与N2a和TM4细胞融合并被摄取,RT-PCR结果表明共孵育1 h后N2a和TM4细胞可以检测到Adam7和Crisp1基因的mRNA。Western印迹结果显示与附睾小体孵育后的N2a和TM4细胞可以检测到CRISP1蛋白。结论:附睾小体可传递附睾特异性mRNA Adam7和Crisp1进入到细胞中,其中Crisp1可能被翻译成蛋白,其功能和意义有待进一步研究。

卵泡刺激素和黄体生成素阈值与阈值窗及卵泡的发育

一年一度的达菲林IVF训练营于2008年5月9～10日在四川峨眉山下举办,本次训练营云集了我国辅助生育技术领域临床经验丰富的专家,也吸引了130多位来自全国各地的生殖医学同道。本期训练营的主题是"超排卵的FSH/LH阈值和卵巢反应性",超排卵中的Gn阈值。探讨给予多少Gn时为卵巢恰当反应、过度反应或低反应。低反应是常见的问题,与年龄因素、卵巢功能储备低下及超排卵方案不当有关。临床上的疑惑是卵泡募集启动初始Gn的阈值该如何掌握,大剂量Gn的应用是否可以纠正低反应?判断低反应的预后指标是什么?至于高反应,特别是对于多囊卵巢综合征(PCOS)病人,卵泡募集FSH阈值的掌握也是难题,因为其恰当反应范围更窄。超排卵中80%正常反应者又如何从FSH阈值探讨恰当的Gn启动剂量?Howles等提出通过年龄、FSH、BMI及AFC等预测因子推测出Gn启动剂量公式,提供一种恰当反应,即获取适当卵子又达到可接受的妊娠率,并减少多胎妊娠与卵巢过度刺激综合征(OHSS)副反应。我国的辅助生育技术已经走过了20多个春秋,过去,我们只是跟随外国技术发展的足迹,按图索骥。如今,我们不断求索,不断进步,已发展了自己的实践和经验,也有自己的发明与创造。IVF的临床妊娠率逐步提高,达到甚至超越国际水平。近年来由超排卵方案衍生的微刺激方案,减少Gn剂量的刺激,带来了接近自然周期的效果,克服了常规的降调超排方案的缺点。"轻刺激——从克罗米芬到来曲唑"是对传统超排卵方案的挑战。

孕酮调节子宫内膜的容受性

胚胎的种植是极其复杂的过程，涉及滋养细胞在子宫腔上皮定位、粘附，胚胎侵入子宫内膜基质伴随基质细胞蜕膜化，雌、孕激素受体的沉默等一系列变化和一系列基因的上调或下调，而孕酮在这一系列变化中发挥关键作用。

种植窗口期人子宫内膜组织中ER、PR及HOXA-11的表达

目的:探讨雌孕激素受体(ER、PR)及同源框基因-11(HOXA-11)在人子宫内膜种植窗口期的表达。方法:采用免疫组化和RT-PCR方法检测ER、PR及HOXA-11在拟行IVF-ET患者排卵后子宫内膜种植窗口期的表达。按IVF-ET后是否妊娠将153例因输卵管因素不孕的患者分为未妊娠组(n=86)和妊娠组(n=67)。结果:免疫组化结果显示PR和HOXA-11在妊娠组腺上皮细胞中的表达均低于未妊娠组(P均<0.001),在间质细胞中的表达均高于未妊娠组(P均<0.001)。RT-PCR结果显示妊娠组子宫内膜ER、PR及HOXA-11 mRNA的相对表达量均高于未妊娠组(P均<0.05)。P水平与腺上皮、间质PR及腺上皮HOXA-11蛋白表达有关(P均<0.05)。结论:种植窗口期内膜腺上皮PR、HOXA-11表达下调和间质细胞PR、HOXA-11表达上调的失败可能是导致子宫内膜容受性下降的原因之一。

人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展

人胚胎干细胞源自囊胚内细胞团 (innercellmass,ICM ) ,能无限增殖并保持未分化状态 (保持完整的、正常的染色体核型 )的细胞。它可分化为来源于 3个胚层的多种细胞。这种特性在世界范围内掀起了对人胚胎干细胞的研究热潮 ,并取得了飞速发展。本文就人胚胎干细胞建系及体外培养分化的研究进展作一综述。

昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞不同接种密度对人胚胎干细胞的影响

目的:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,观察其不同接种密度对人胚胎干细胞的克隆生长情况及分化率的影响。方法:实验于2003-07/2005-03华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。首先进行小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养。选取2～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,待其至对数生长期倒掉或吸掉培养基,加入含10mg/L丝裂霉素C的细胞全培养液5mL,置37℃,体积分数0.05的CO2饱和湿度温箱中培养二三小时,在6孔板中加入0.1%明胶包被,放置30min以上,倒掉或吸掉含丝裂霉素C的培养基,磷酸盐缓冲液(-)清洗5遍,尽量除去丝裂霉素C,加入2mL0.05%的胰蛋白酶消化细胞,镜下观察,当细胞间出现裂隙,细胞变圆时(约2～4min),立即加入等量的全培养液终止消化,并用吸管反复吹打,使之成为单细胞悬液,在细胞计数板中央放置专用的盖玻片,用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液,至盖玻片下被液体充满为止。用细胞计数板计算活细胞数,并分别按3×108、5×108、1×109L-1密度接种,机械法平均分人胚胎干细胞克隆,5个克隆/孔接种于不同密度的小鼠胚胎成纤维细胞上。观察克隆的生长情况及分化率,分化率=(完全分化克隆数+部分分化克隆数)/(完全分化克隆数+部分分化克隆数+未分化的克隆数)。结果:胚胎干细胞克隆在3×108L-1密度的小鼠胚胎成纤维细胞上生长极易分化,贴壁48h后无生长,72～96h分化率(98.0±2.0)%;接种于5×108L-1的小鼠胚胎成纤维细胞上后,胚胎干细胞生长与分化共存,贴壁后48h部分克隆生长,下次传代前分化率分化效率为(30.0±5.0)%;在1×109L-1小鼠胚胎成纤维细胞上,胚胎干细胞克隆贴壁后48h即开始生长,分化率为(1.0±0.2)%。3组之间分化率差异有显著性意义(P<0.05)。结论:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,1×109L-1可以起到促进胚胎干细胞的增殖,并抑制其分化的作用。

FSH和LH的作用

卵泡是卵巢内分泌和生殖的基础单位，是不可再生的组织，其数量和消耗的速度决定了生殖潜能和生育期限。出生后的卵泡由初级卵母细胞和颗粒细胞组成，根据卵母细胞的大小和颗粒细胞的形态和数量可分为：始基卵泡；初级卵泡；次级卵泡。次级卵泡构成了窦前卵泡池，依赖于卵泡刺激素（FSH）的卵泡募集开始于此。

人工干预对反复种植失败患者着床窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11表达的影响

目的:探讨对反复种植失败(RIF)患者进行人工干预后,着床窗口期子宫内膜组织中溶血磷脂酸受体3(LPAR3)和同源框基因11(HOXA-11)表达变化对临床结局的影响。方法:将92例因输卵管因素不孕的RIF患者分为搔刮组(子宫内膜搔刮,n=31)、中成药组(调经促孕丸,n=31)、未干预组(n=30)。采用RT-PCR和Western blot方法检测3组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11 mRNA和蛋白表达的情况,并观察3组患者临床妊娠率的差异。结果:搔刮组、中成药组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11 mRNA及蛋白表达量高于未干预组,差异有统计学意义(F=57.463和60.771,P<0.001;F=48.816和40.313,P<0.001),而前两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。搔刮组、中成药组复苏周期临床妊娠率分别是48.4%和32.3%,均高于未干预组(16.7%),差异有统计学意义(χ2=6.908,P=0.032),但前两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:子宫内膜搔刮术和口服调经促孕丸2种干预措施均可以改善子宫内膜容受性,提高RIF患者的临床妊娠率。

促性腺激素峰的作用与人绒毛膜促性腺激素诱发排卵

黄体生成素（LH）峰是即将排卵的可靠指标，出现于卵泡破裂前34～36h，通常持续48～50h，LH阈值必须维持14～27h，才可确保排卵前卵泡的最后完全成熟。促性腺激素（Gn）峰对卵细胞最后成熟、孕酮的合成、排卵、黄体形成等一系列复杂的生理过程都是至关重要的。LH峰出现到排卵前卵泡发生了显著的变化。诱发排卵前颗粒细胞和卵母细胞发生许多关键变化，如抑制颗粒细胞增殖基因的转录、丢失缝隙连接、诱导排卵所需要的基因如环氧合酶2等。

促性腺激素制剂使用的历史回顾

促性腺激素（Gn）使用的历史是伴随着科学技术的发展和人们对Gn的作用逐步深入理解而不断地发生变化。随着科学技术的发展，人们从使用孕马血清、垂体提取物、尿Gn直至使用基因重组的Gn，尿杂质蛋白量逐渐减少直至完全消失，同时药物的消费额也增加了5倍多，从1995年是5百万欧元，到2000年的26．8百万欧元，而药物消费量增长则不到一倍。

荧光染色技术在精子检测中的应用

近20年来,随着荧光染色技术的不断发展完善,其在检测精子染色质、质膜完整性、线粒体活性、精子获能状态及顶体状态等方面取得成功。荧光染色技术利用荧光染色试剂能特异的与精子染色质、质膜、线粒体和顶体上某些成分结合,在激发光激发下能发出肉眼可见的荧光并在荧光显微镜下观测,从而迅速、准确地了解精子各方面的功能。该技术的应用有助于了解精子的受精能力,为选择助孕方式提供可靠依据,尤其对原因不明不孕症患者的诊断治疗,更见优势。目前多主张两种或三种方法联合使用,如:三重染色法同时检测精子质膜、线粒体活性和顶体状态。

卵巢过度刺激综合征中囊性纤维化跨膜转导调节器的表达

目的:探讨囊性纤维化跨膜转导调节器(CFTR)在卵巢过度刺激综合征(OHSS)发病中的变化及意义。方法:22日龄未成年Wistar雌鼠随机分为过度刺激组(实验组,n=16)和常规刺激组(对照组,n=16),PMSG10IU1d,连续腹腔注射4d,d5注射hCG30IU;对照组PMSG仅注射2d,hCG减量为10IU。测血E2水平,尾静脉注入美兰液,30min后取腹腔灌洗液和卵巢,用分光光度计测定腹腔灌洗液和卵巢组织中美兰含量,以判断腹膜和卵巢血管通透性;采用免疫组织化学法和免疫印记法检测卵巢CFTR蛋白表达量。结果:实验组大鼠卵巢重量、血E2水平、腹腔液和卵巢中美兰含量显著高于对照组;免疫组化法检测到CFTR表达于卵巢黄体细胞以及未排卵泡的黄素化颗粒细胞和卵泡膜细胞胞浆,免疫组化和免疫印记定量分析均显示实验组卵巢CFTR蛋白表达量显著高于对照组。结论:血清E2水平异常升高,使体内CFTR表达量显著增加从而参与OHSS的一些病理生理变化。

脂联素与多囊卵巢综合征代谢紊乱

脂联素(adiponectin)是最近发现的脂肪特异性蛋白,可以影响血糖血脂代谢,改善胰岛素抵抗,抗动脉粥样硬化等,对代谢综合征的发生发展起着重要作用;而多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)的患者存在肥胖、脂质与糖代谢异常、胰岛素抵抗、心血管病变等代谢综合症的表现,本文分别从基因水平和代谢水平综述脂联素与PCOS内分泌代谢紊乱的相关联系。

肝素结合性表皮生长因子及其受体在胚胎着床中的作用研究进展

着床是胚胎通过与子宫内膜相互作用而植入子宫的过程,正常子宫内膜仅在某一特定时期允许胚胎着床,这一时期被称为＂着床窗口期＂[1],是子宫内膜容受性最高的时期,。这一复杂的生理过程除受雌、孕激素的协调作用外,

玻璃化冷冻技术与单胚胎移植

随着辅助生育技术（ART）开展的越来越普遍，妊娠率的逐渐提高，多胎妊娠已成为除卵巢过度刺激综合征（OHSS）外最主要的并发症。为了降低多胎率，越来越多的中心开始实施单胚胎移植。比利时已制定单胚胎移植的法律。提高单胚胎移植的成功率的方法之一是单囊胚移植，而要实现单胚胎移植，特别是单囊胚移植，首先必须要改善培养条件提高囊胚的形成率，另一方面是必须要有可靠和简便的冷冻方法，以保证剩余胚胎能安全的冻存，以确保患者的累积妊娠率。

CFTR在超排卵幼龄大鼠卵巢的分布与表达

目的探讨囊性纤维化跨膜转导调节器(CFTR)在超排卵幼龄大鼠各期卵泡和黄体中表达的变化及其意义。方法采用免疫组化和免疫印迹方法检测超排卵幼龄Wistar大鼠注射HCG前,注射HCG后24h、48h及72h卵巢中CFTR的蛋白分布与含量变化。结果CFTR在超排卵幼龄Wistar大鼠的各级卵泡颗粒细胞、黄体细胞均有表达,随着黄体期延长其表达量逐渐下降,各时段卵巢表达量比较有显著性差异。免疫印记法证实各时段卵巢中均存在特异性的、相对分子质量为170KD的CFTR条带。结论卵泡期CFTR表达可能促进卵泡中卵泡液的积聚,卵泡直径增大,利于卵泡成熟;而黄体期CFTR表达下降则可能利于黄体形成,CFTR过多表达可能导致卵泡囊肿和黄体囊肿。

反复IVF-ET失败后宫腔镜对患者妊娠率的影响

目的：研究反复IVF-ET失败后宫腔镜对宫腔状态的判断在后续助孕治疗中是否可以提高IVF患者妊娠率。方法：2010年1月～2013年1月在华中科技大学附属同济医院生殖中心曾行IVF-ET失败要求再次行IVF-ET患者共406例。纳入标准：年龄20～39岁，既往行IVF-ET失败≥2次。患者第1次IVF-ET周期前均进行阴道B超检查及子宫输卵管造影，提示子宫及子宫内膜无明显异常表现,胚胎移植平均为2个优质胚胎。以IVF-ET失败术后再次行胚胎移植前患者是否行宫腔镜检查分为A和B组，A组为行宫腔镜治疗组，有205例；B组为未行宫腔镜治疗组，有201例，根据宫腔形态将A组又分为AI（宫腔形态正常）和AII（宫腔形态异常组）。分析并比较各组间的着床率、临床妊娠率。结论：作为评价子宫内膜最好的办法，宫腔镜1，可以检出B超及子宫输卵管造影未检出的微小宫腔病变，并行相应的微创治疗，可以提高反复IVF-ET失败者的着床率、临床妊娠率。

建立卵巢过度刺激综合征大鼠模型的研究

目的构建卵巢过度刺激综合征(OHSS)的大鼠模型。方法32只未成年Wistar雌鼠,随机分为常规刺激组和过度刺激组。过度刺激组:22日龄Wistar雌鼠连续4天皮下注射含有10 IU PMSG的生理盐水0.2ml,至26日龄皮下注射含有30 IU hCG的生理盐水0.2ml。设立对照组为常规刺激组:24日龄Wistar雌鼠皮下注射含有10IU PMSG的生理盐水0.2ml,再予皮下注射含有10IU hCG的生理盐水0.2ml。测血E2水平,尾静脉注入美兰溶液30min后取腹腔灌洗液和卵巢,用分光光度计分别测定腹腔灌洗液和卵巢组织中的美兰含量来判断腹膜和卵巢血管通透性;比较两组间卵巢重量,血E2水平及卵巢、腹腔液中美兰含量。结果注射hCG 48h后,过度刺激组大鼠卵巢重量、血E2水平、腹腔液和卵巢中美兰含量均显著高于常规刺激组。结论利用适当日龄Wister大鼠可以成功构建OHSS动物模型。

内膜搔刮对RIF患者子宫内膜着床窗口期LPAR3和HOXA11表达的影响及临床意义

目的探讨对反复移植失败（RIF）患者进行内膜搔刮后，比较溶血磷脂酸受体3（LPAR3）和同源框基因11（HOXA11）在搔刮组与对照组子宫内膜着床窗口期蛋白的表达差异及临床结局。方法前瞻性纳入61例因输卵管因素不孕行IVF—ET助孕治疗的RIF患者作为研究对象，搔刮组31例患者于冻胚复苏移植的前1个月经周期月经来潮6h内进行内膜搔刮，对照组30例患者在冻胚复苏移植前未行内膜搔刮。采用免疫组化和WesternBlot的实验方法，检测LPAR3和HOXAll在以上两组RIF患者排卵后5～7天子宫内膜窗口期蛋白表达量的差异和临床结局。结果两组患者在年龄、不孕年限、体重指数（BMI）、促性腺激素（Gn）天数、Gn总量、获卵数、胚胎移植数、移植日内膜厚度、基础血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）及孕酮（P）及着床窗口期血清雌二醇（E2）、P水平相比较，差异无统计学意义（P〉0．05），搔刮组生化妊娠率、胚胎着床率、临床妊娠率及持续妊娠率均高于对照组，有统计学差异（P〈0．05）。免疫组化结果显示搔刮组腺上皮LPAR3及间质HOXAll在子宫内膜着床窗口期的表达量明显高于对照组，而搔刮组腺上皮HOXAll在子宫内膜着床窗口期的表达量明显低于对照组，差异有统计学意义（P〈0．001）。WesternBlot结果显示搔刮组LPAR3和HOXAll蛋白在着床窗口期的表达量明显高于对照组，有统计学差异（P〈0．001）。结论子宫内膜搔刮术可以提高LPAR3和HOXAll的表达量，从而改善子宫内膜容受性，提高RIF患者的临床妊娠率。