合成生物学的研究方向与应用

分析构建合成生物学元件的基本思路、研究原理和研究方法,阐述当前合成生物学的两个主要研究方向——最小生命体研究与合成元件的开发的国内外最新研究成果.前者的重点在于找到能维持生命的最少量基因,而后者的重点在于如何建立与天然细胞中相类似的功能元件,并使其能在宿主中顺利运行.两个研究方向出发点不同,但研究目标是一致的,其研究成果最终可以互相借鉴与融合.利用人工合成的最小生命体作为宿主,配合各种不同的生命功能元件合成生命元件,组装系统网络,最终创造出人造生命.同时,概要地指出了合成生物学的发展前景.

一种可控制生物微胶囊尺寸的气流微囊发生器

控制胶珠或胶囊的尺寸是生物微胶囊在人工器官和细胞固定化应用方面的要求。建立了一种通过气流作用于针头出口处的液滴,来制备比较均一的、可控尺寸微胶囊的方法。通过对针尖出口处液滴的受力分析,建立了描述液滴尺寸和气体出口处流速之间关系的方程。通过该方程可以根据对胶珠(或胶囊)尺寸的需要,计算得到应该实际控制的气流速度。最后通过Alginate/Ca凝胶珠和NaCS/PDMDAAC微胶囊两种体系,在不同气流速度下获得的胶珠和胶囊尺寸,对建立的方程进行了实验验证,并同时对制得的胶珠和胶囊的尺寸分布进行了表征。实验结果表明,通过气流法可在1.0mm^2.6mm范围内获得尺寸较均一的胶囊和胶珠。

克雷伯杆菌利用生物柴油副产物甘油生产氢气和1,3-丙二醇的研究

以Klebsiella pneumoniae DSM2026为出发菌株，通过紫外线诱变，选育得到能耐较高浓度生物柴油副产物甘油生产H2和1，3-丙二醇（1，3-PD）的菌株21株，命名为Kp1～Kp21。通过比较，Kp8菌株产量最高，1，3-PD和H2产量分别达到0．36g/50mL和0．99mmol/50mL，比出发菌株分别提高了3．5倍和4．2倍。对Kp8菌株发酵条件进行优化，得到最佳培养条件为pH7．0，培养温度37℃，接种量10％（v/v），废甘油浓度为30g／L。在该条件下H2产量为1．0mmoL/50mL，1，3-PD产量为7．5g/L，甘油转化率为83．3％。

PEC生物微胶囊研究进展

聚电解质复合物(PEC)生物微胶囊由聚合物阴阳离子络合反应形成,因其反应温和、生物相容性好,近年来已成为热门的研究领域,在人工器官、医疗诊断、细胞固定化等方面有着广泛的用途。本文系统介绍了PEC生物微胶囊的制备、特性研究和应用研究,并综述了这3个方面的最新研究进展,最后对PEC生物微胶囊的发展前景进行了展望。

生物微胶囊固定化Candida krusei的研究

以一种新型NaCS/PDMDAAC(sodium cellulose sulfate/poly[dimethyl(diallyl)ammonium chloride])生物微胶囊体系包埋耐高渗型产甘油酵母Candia krusei ICM-Y-05。较详细研究了C.krusei在囊内的生长曲线,以及葡萄糖和甘油在囊内外随培养时间变化的情况。结果表明,经生物微胶囊包埋后的细胞在囊内具有二次生长现象。对固定化细胞培养过程中传质系数的测定表明,细胞在囊内的生长对胶囊传质特性有较大的影响,而囊内活细胞数随培养时间的变化并没有减少的趋势,从侧面证明了传质会部分改变囊内细胞生理代谢特性。

克雷伯杆菌诱变菌株利用生物柴油副产物甘油制备3-羟基丙醛

应用克雷伯杆菌诱变菌株(Kp8)分别在游离与固定化态下转化生物柴油副产物甘油(粗甘油)制备3-羟基丙醛(3-HPA)。结果发现,Kp8在含30 g/L粗甘油发酵培养基(实验条件I)中较初始克雷伯杆菌(Kp0)在含30 g/L纯甘油培养基(实验条件II)中发酵产3-HPA的相对产率提高了13.75%;Kp8与Kp0经溶胶-凝胶法固定后分别在实验条件I、II下发酵,前者3-HPA相对产率为游离Kp0的73.75%,后者为65.6%;固定化细胞分别进行了7个批次的发酵,实验条件I中3-HPA相对产率由80%降至60%,3-HPA总得率从0.321 g/g降到0.243 g/g,3-HPA转化率从40.1%降到30.4%,实验条件II中3-HPA相对产率维持在70%~80%水平,3-HPA总得率维持在0.315 g/g^0.276 g/g,3-HPA转化率维持在39.4%~34.5%。

米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因gsdA的克隆及生物信息学分析

6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸,并生成NADPH,是微生物胞内磷酸戊糖途径(PPP)的关键酶。本研究以食品安全菌米曲霉CICC2012为材料,克隆获得6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(GenBank登录号:JN123468)。序列分析表明,该酶是由222个氨基酸组成的亲水性蛋白;128～134位氨基酸序列DHYLGKE为活性区域;170～176位氨基酸序列GTEGRGG可能为辅因子结合位点。进化树分析表明,米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶同其他丝状真菌及酵母的G6PDH较相似。

源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成与抑制机理

探讨源于马铃薯多酚氧化酶(PPO)的酶活性中心必需基团组成与抑制剂对PPO的抑制作用类型。应用具有相对专一性的氨基酸基团化学修饰剂溴乙酸(BrAC)、乙酰丙酮(Hacac)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、1,4-二硫代苏糖醇(DTT)与对氯汞苯甲酸(pCMB)等对PPO进行化学修饰反应,确定源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成为组氨酸(His)的咪唑基、精氨酸(Arg)的胍基与色氨酸(Trp)残基,二硫键对酶活性中心的稳定有贡献作用但游离的硫基不是酶反应所必需的基团。抑制动力学实验表明乙醇对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.12 mmol/L,抑制类型为竞争性可逆抑制,苯甲酸对PPO的IC50为0.07 mmol/L,抑制类型为非竞争性可逆抑制。说明乙醇通过与PPO酶活中心结合抑制PPO酶活性而苯甲酸则通过与PPO非酶活中心的结合抑制PPO酶活。

链霉菌G-HD-4产黑色素的提取及理化性质

对链霉菌G-HD-4发酵液采用酸沉淀、碱性溶液提取、酸水解,以及多种有机溶剂抽提等工艺手段分离、纯化出黑色素,研究其理化性质.结果表明,该黑色素的最大吸收峰为246 nm,与标准黑色素最大吸收峰相一致.在400 nm波长下,其光密度值(D)随黑色素质量浓度的增加而增大;容易被强氧化剂所氧化,而紫外、光照、温度、有机溶剂、还原剂、各种盐,以及金属离子对黑色素的影响较小,氨基酸、淀粉等添加物对黑色素稳定性没有影响,说明该黑色素稳定性良好.

可溶性低聚壳聚糖的制备与抗菌性能研究

碱法提取壳聚糖,产品得率为5.28%,脱乙酰度81.7%,特性粘度10.550,分子量54.42×104;用H2O2氧化降解壳聚糖,获得分子量分别为32.3×104、6.7×104、0.496×104的样品;抗菌实验表明随着低聚壳聚糖分子量和浓度的增大,对金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌等阳性菌的抗性作用增强。

富士苹果中多酚氧化酶活性的中心必需基团与抑制动力学

以源于苹果的多酚氧化酶(PPO)为对象,选取溴乙酸、乙酰丙酮、N-溴代琥珀酰亚胺、1,4-二硫代苏糖醇和对氯汞苯甲酸等具有相对专一性的氨基酸基团修饰剂,研究PPO的酶活性中心必需基团,并确定乙醇对PPO的抑制动力学特性.结果表明:富士苹果中的PPO蛋白结构中酶活性中心必需基团有组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基与色氨酸残基.抑制动力学实验表明:乙醇通过与PPO酶活中心基团的结合抑制PPO酶活性,其对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.14mmol.L-1,抑制类型为可逆的竞争性抑制.

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.

化学混凝法处理制革废水中铬的研究

试验研究了化学混凝法对制革废水中Cr6+、总铬的去除效果及作用机理。实验结果表明:在硫酸亚铁投加质量浓度为400mg/L,pH为6.5,快速搅拌1min(搅拌强度250r/min),慢速搅拌29min(搅拌强度65r/min)条件下,Cr6+、总铬去除率可分别达到97.2%、83.2%。比较不同的絮凝剂发现,聚合硫酸铁投药量较小,处理效果好,采用其去除制革废水中Cr6+及总铬经济、有效。

微波辅助酸水解麦糟制备低聚木糖的工艺

采用单因素法,考察了酸浓度、提取时间、浸泡时间、微波功率和料液比(麦糟质量与水的体积的比)对低聚木糖提取率的影响,并在此基础上用正交设计对低聚木糖的提取工艺进行优化.实验结果表明,微波辅助提取低聚木糖的优化工艺组合为磷酸浓度为0.8 mol.L-1,提取时间为25 min,浸泡时间为0.5 h,微波功率为440 W,料液比为1∶50.在此工艺条件下,低聚木糖的提取率为49.87%,平均聚合度为3.49.

克雷伯杆菌甘油脱氢酶基因的克隆表达与纯化

以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA),并克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-gldA。经测序正确后,将gldA亚克隆至表达载体pET-32a(+)上构建表达质粒pET-32gldA。在乳糖诱导下,携带pET-32gldA的E.coli BL21(DE3)高效表达分子量约为54kD的可溶性蛋白。表达产物带有His6-tag标记,选用Ni柱对表达产物进行纯化,纯化后酶液的比活为188u/mg,纯化倍数和回收率分别为3倍和67.5%。

一株胶原酶产生菌的筛选及系统发育分析

从所采集土样、水样中分离筛选到呈革兰氏染色阳性,柱状产芽孢编号为LY-t1的菌株.通过对此菌进行牛皮消化实验,并以Ⅰ型胶原为底物,测定该菌发酵培养液中胶原酶活性,确认此菌具有胶原酶活性.16S rDNA序列分析表明,分离菌株与Bacillus megaterium具有98%相似性.最后,用PHYLIP程序将该菌株与报道的相关胶原酶产生菌进行系统发育进化分析.

克雷伯杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质

在有氧条件下，利用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子离子交换层析和Blue Sepharose CL-6B亲和层析，同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内的1，3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶．研究表明，1，3-丙二醇氧化还原酶的纯化倍数为35．86倍，回收率为5．17％，该酶最适表观反应温度为57℃，最适反应pH值为9．5．在30℃及pH-8．0～10．0时，该酶具有良好的稳定性．在45℃和pH-9．5条件下，该酶以1，3-丙二醇和NAD^＋为底物，其米氏常数K。分别为15．8，0．2mmol·L_。．1，3一丙二醇氧化还原酶对生理反应底物3-羟基丙醛活性最大，对其他醇类也有氧化能力．Mn^2＋对酶有显著激活作用，巯基保护剂能明显提高酶的活力．

麦糟水解液中单糖及脂肪酸的HPLC分析

建立高效液相色谱（HPLC）测定麦糟水解液中的单糖及脂肪酸的分析方法，检测条件：色谱柱为Aminex HPX-87H柱，柱温为50℃，流动相为5mmol·L^-1的硫酸，流速为0．4mL·min^-1，检测器为示差折光检测器．在此条件下，水解液中的单糖及脂肪酸的峰面积与浓度线性关系良好，相关系数R。在0．99991～0．99998之间，回收率为97．3％～101．5％．通过对样品的分析表明，麦糟水解液中不含有葡萄糖、甲酸及乙酰丙酸，木糖和阿拉伯糖的质量浓度比较高，乙酸的质量浓度比较低，单糖及脂肪酸的混合液得到很好的分离，分离过程在23min内完成．

固定化Klebsiella penumonia制备3-羟基丙醛

用溶胶-凝胶(sol-gel)法包埋克雷伯杆菌细胞转化甘油制备3-羟基丙醛(3-HPA),考察了凝胶制备中的反应前驱体、改性剂对固定化细胞发酵水平的影响。结果表明,前驱体采用硅酸钠(sodiumsilicate),3-HPA发酵水平较采用正硅酸乙酯(TEOS)的提高了57.14%;改性剂采用聚乙二醇、葡萄糖、麦芽糖,3-HPA发酵水平分别为不添加改性剂时的110%,98.12%和90.1%。以硅酸钠为前驱体,不添加改性剂和添加不同改性剂固定化克雷伯杆菌细胞后,连续发酵7个批次,前者3-HPA发酵水平维持在70%～80%,后者3-HPA发酵水平分别稳定在80%～93.5%,69%～78%,78%～83%。添加聚乙二醇的固定化细胞保持了较高的3-HPA发酵水平,在批次发酵中它的3-HPA总得率保持在0.480～0.561g/g。

产几丁质酶菌株的分离与鉴定及产酶条件优化

从土壤中分离到一株产几丁质酶的细菌LL-C.该菌经16S rDNA序列同源性分析及形态培养特征、生理生化特征分析,鉴定为Luteibacter rhizovicinus,属于黄单胞菌科(Xanthomonadaceae).以不同发酵时间、碳源、氮源、起始pH值、培养基装液量和培养温度为因素,考察LL-C菌株产几丁质酶的优化条件.结果表明,最有利于该菌产几丁质酶的条件:碳源为胶体几丁质、氮源为(NH4)2SO4,培养基起始pH值为4.5,培养基装液量为30 mL,培养温度为32℃,振荡培养时间为7 d,此优化条件下,摇瓶产酶活力为115.02μkat.L-1.