我国生态农业与绿色食品开发的探讨

针对我国农业和食品发展要实现的目标,阐述了生态农业和绿色食品的紧迫性、内涵以及二者的关系。

增强破伤风疫苗效价方法研究

研究探索增强破伤风疫苗效价的方法。方法 用戊二醛醛化交联蛋白并使之产生多聚体的特性,以不同条件戊二醛处理破伤风疫苗核心有效成分破伤风类毒素(TT)蛋白样品,通过液相色谱法测定TT醛化最佳浓度及醛化时间,样品稀释后接种NIH小鼠观察预防破伤风毒素攻击效果计算效价,以找到最佳聚合工艺条件,从而为开发安全、高效的破伤风疫苗积累一定的理论依据。结果 0.03%戊二醛醛化6h、8h及0.05%戊二醛醛化2h后TT纯度、聚合度均较好。采用这三TT免疫小鼠,疫苗效价结果显示0.03%的戊二醛醛化6h后效价最高,为224IU/mL。结论 本研究通过使用戊二醛醛化TT,并探索其最佳的醛化条件,使其醛化后TT样品的效价得到了很大的提高。

150 L生物反应器规模化扩增狂犬病病毒工艺的建立

目的建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础。方法应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20 g/L,培养温度36~38℃,DO 20%~60%,pH 7.0~7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测。结果30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×10^(7)个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225~2.173,P=0.096~0.833)。2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD_(50)/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374)。2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致。结论可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准。

群体倍增水平评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性

目的采用群体倍增水平(population doubling level,PDL)评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性,并进行验证,以期为该细胞工业化生产培养提供实验依据。方法将工作种子批HEK293细胞连续传代60 d,每2 d传1代,评价PDL增加至10~60时的细胞稳定性。通过相关研究结果计算获得当HEK293细胞传代培养至2500 L规模时,各代PDL应控制在2±0.2范围内。将工作种子批HEK293细胞经摇瓶(125、500、1000、3000 mL,共传4代)、细胞扩增系统(cell expansion system,CES)(25、25及50 L,共传3代)、生物反应器(100、500、500,共传3代)阶段培养,各代PDL均控制在2±0.2范围内,共培养3批,并分析细胞密度、活率、结团率、直径等指标。500 L生物反应器培养HEK293细胞72 h,按MOI=5~10接种工作种子批腺病毒,培养2 d,收获病毒培养液,检测病毒颗粒数。结果工作种子批HEK293细胞连续传代至PDL达60时仍能维持较高的细胞密度和活率。将PDL控制在2±0.2范围内,3批HEK293细胞在摇瓶、CES、生物反应器培养阶段的密度均>2.0×10^(6)个/mL,活率均>96%,细胞直径约为17μm;结团率均<35%。3批500 L生物反应器培养的HEK293细胞接毒2 d后,病毒颗粒数分别达11.68×10^(10)、12.55×10^(10)和9.38×10^(10)vp/mL。结论采用PDL评价HEK293细胞传代稳定性是可行的,可更科学地反映传代细胞的生长状态。

重组E.coli宿主中质粒DNA拷贝数qPCR检测方法的建立及验证

目的建立重组E.coli宿主中质粒DNA(pDNA)拷贝数的qPCR检测方法,并进行验证,以期为mRNA疫苗研发提供可靠的检测方法。方法根据E.coli Top10基因组DNA序列设计用于qPCR扩增的引物及探针,并优化引物浓度。提取重组E.coli/pUC57-HA的全DNA(宿主DNA+pDNA),以其为模板,建立pDNA拷贝数的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、特异性及重复性。将重组E.coli/pUC57-HA于37℃培养24 h,每2 h取样,采用建立的方法检测pDNA拷贝数。结果确定最佳引物(F/R)浓度均为0.5μmol/L。重组E.coli/pUC57-HA全DNA在10~1~10~5倍稀释范围内,与Ct呈良好的线性关系,R^(2)均=1.00;E.coli/pUC57-HA及E.coli Top10的扩增结果为阳性,阴性对照(ddH_(2)O)未见扩增曲线;3次重复检测重组E.coli/pUC57-HA的pDNA拷贝数CV<5%。E.coli/pUC57-HA培养0~6 h期间pDNA拷贝数呈平稳趋势,6~12 h期间呈下降趋势,12~16 h期间呈增长趋势,16~24 h又趋于平稳。结论建立的qPCR法具有良好的特异性及重复性,可用于重组E.coli宿主中pDNA拷贝数的检测,有效监测菌株培养过程中pDNA含量变化。

脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研究进展

脑膜炎球菌多糖结合疫苗基本采用化学结合方式制备,最常用的方式为酰胺缩合反应,由于多糖与蛋白以共价键形式结合,因此制备的结合疫苗稳定性较高,具有较好的技术优势,在脑膜炎球菌相关疾病预防中发挥重要作用。脑膜炎球菌多糖结合疫苗应用于2岁以内婴幼儿的免疫接种,保护效果持久。本文就脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备的影响因素、多糖与载体蛋白的结合方式、国内外现状以及制备过程中存在的问题进行综述。

甲醛灭活工艺对By型流感病毒的灭活效果及其抗原稳定性的影响

目的评价终浓度为100μg/ml甲醛、2~8℃、10 d灭活工艺对2022年四价流感病毒裂解疫苗生产用By(B/Phuket/3073/2013/BVR-1B)病毒毒株灭活的适用性。方法病毒收获液(鸡胚病毒培养产物)经过澄清过滤,控制蛋白浓度<800μg/ml,温度2~8℃,添加甲醛溶液至终浓度100μg/ml,对病毒收获液进行灭活。在灭活第0、1、2、3、4、5、10天取样,采用鸡胚半数感染剂量(median infective dose,EID50)法检测病毒滴度,采用Reed-Muench法计算lgEID50/ml;采用直接血凝法检测流感病毒血凝滴度;对灭活10 d的样品进行病毒灭活验证试验;灭活10 d后的病毒液经超滤、离心、层析等工艺提纯,取样进行透射电镜观察病毒颗粒完整性。结果病毒收获液灭活第0、1、2、3、4、5、10天的病毒滴度分别为(8.5±0.4)、(4.2±0.5)、(1.3±0.4)、0、0、0、0 lgEID_(50)/ml,血凝滴度结果均在1∶256~1∶512;病毒灭活验证试验显示,经过10 d的灭活,病毒均已全部灭活;透射电镜观察显示,所得的病毒均为完整病毒颗粒。结论终浓度100μg/ml甲醛、2~8℃灭活10 d的灭活工艺可用于By(B/Phuket/3073/2013/BVR-1B)流感病毒的灭活处理。

2022年某国产儿童四价流感病毒裂解疫苗质量检测分析

目的 回顾评估某国产儿童四价流感病毒裂解疫苗关键质量指标,分析疫苗的有效性、安全性和批间一致性。方法以某国产公司生产的14批儿童四价流感病毒裂解疫苗为研究样品,检测样品血凝素含量、总蛋白含量、总蛋白/血凝素比值、卵清蛋白含量、细菌内毒素含量、游离甲醛含量,和企业注册标准、中国药典标准及WHO标准比较,同时计算标准差(s),评价产品质量。结果 14批儿童四价流感病毒裂解疫苗血凝素含量为31.9~35.9μg/m L(s 0.6~1.2)、总蛋白含量223.4~256.0μg/mL(s 9.0)、总蛋白/血凝素比值1.7~1.8(s 0.06)、卵清蛋白含量0.84~2.32 ng/mL(s 0.47)、细菌内毒素含量0.03~0.04 EU/mL(s 0.004)、游离甲醛含量2.05~2.70μg/mL(s 0.23),检测符合标准要求。结论 该国产儿童四价流感病毒裂解疫苗14批产品检测结果均符合企业注册标准、中国药典标准及WHO标准,批间一致性好,产品具有良好的安全性和有效性。

H1N1型流感病毒生长曲线的测定

探究2023年由WHO公布的H1N1型毒株A/Victoria/4897/2022(AH1N1pdm09)制备的高生长重组流感病毒(IVR-238)的生长规律,为流感疫苗生产中的病毒培养时间提供指导。方法 将H1N1型流感病毒(IVR-238)接种至9-11日龄鸡胚绒毛尿囊腔内,于温度33.0~35.0 ℃、湿度45%~65%的环境下进行病毒培养,分别在不同培养时间(24 h、32 h、48 h、56 h、64 h、72 h)收取鸡胚的尿囊液,进行血凝滴度检测以确定病毒增殖情况,并依据血凝滴度检测的结果及培养时间绘制出病毒的生长曲线。结果 H1N1型流感病毒(IVR-238)滴度在24~56 h呈上升趋势,56~64 h趋于稳定,处于平稳期,在64~72 h呈下降趋势。结论 H1N1型流感病毒(IVR-238)接种鸡胚后,在24~56 h迅速增殖,病毒量在56~64 h趋于稳定,处于平稳期,在64~72 h呈下降趋势,H1N1型流感病毒(IVR-238)的最佳病毒培养时间为56~64 h。

四价流感病毒裂解疫苗安全性和免疫原性评价

目的评价某公司生产的四价流感病毒裂解疫苗(四价流感疫苗)安全性和免疫原性。方法选择河南省舞阳县和西平县≥3岁的健康人群为研究对象,按照1∶1∶1随机纳入试验组、对照1组和对照2组,分别接种四价流感疫苗、三价流感疫苗(不含Bv型)和三价流感疫苗(不含By型);检测接种前后血凝抑制(HI)抗体滴度,分析接种后疑似预防接种异常反应(AEFI)发生率、HI抗体阳转率、HI抗体保护率和几何平均滴度(GMT)增长倍数,并与欧盟和美国食品药品管理局(FDA)制定的流感疫苗质量标准(HI抗体阳转率>40%、HI抗体保护率>70%和HI抗体GMT增长倍数>2.5)比较。结果纳入2 924人,其中试验组975人,对照1组974人,对照2组975人。接种后30 min~<8 d,试验组AEFI发生率为11.7%,高于对照1组的7.9%和对照2组的8.8%(P<0.05)。试验组H1N1型、H3N2型、By型和Bv型HI抗体阳转率分别为78.5%、53.3%、78.3%和62.9%,试验组与对照2组By型HI抗体阳转率的率差为42.1%(95%CI:38.0%~46.2%),与对照1组Bv型HI抗体阳转率的率差为33.2%(95%CI:28.9%~37.5%),95%CI的下限均>-0.10。试验组、对照1组和对照2组各型HI抗体GMT增长倍数均≥2.5。试验组H1N1型、H3N2型、By型和Bv型HI抗体保护率分别为87.7%、98.7%、93.6%和77.2%,其中By型HI抗体保护率高于对照2组的71.1%(P<0.05),Bv型HI抗体保护率高于对照1组的51.0%(P<0.05)。结论接种某公司四价流感疫苗后,H1N1型、H3N2型、By型和Bv型的HI抗体阳转率、HI抗体保护率和GMT增长倍数均达到欧盟和FDA制定的流感疫苗质量标准,该四价流感疫苗的安全性和免疫原性与同公司的三价流感疫苗(包括不含Bv型、不含By型)处于同一水平。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在9~65岁健康人群中的安全性与免疫原性研究

目的评价冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)以不同免疫程序在9~65岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、同类疫苗阳性对照的试验设计开展临床研究,于2015年3月,在河南省登封市和泌阳县招募9~65岁健康人群为研究对象。共纳入1 956名受试者,按1∶1∶1随机分配至5剂对照组、4剂试验组和5剂试验组,每组652名。5剂对照组按照0、3、7、14、28 d免疫程序接种对照疫苗,4剂试验组按照0、7、21 d免疫程序(2-1-1程序)接种试验疫苗,5剂试验组按照0、3、7、14、28 d免疫程序接种试验疫苗。采用定期随访和主动报告相结合的方式,观察首针疫苗接种至全程疫苗接种后30 d局部和全身不良反应,并分析比较三组不良反应发生率。于免疫前、首针接种后7 d、首针接种后14 d和全程接种后14 d采集静脉血,通过快速荧光灶抑制试验检测狂犬病病毒中和抗体,计算血清抗体阳转率和抗体几何平均浓度(GMC)。结果 5剂对照组、4剂试验组、5剂试验组不良反应发生率分别为41.87%(273/652)、35.43%(231/652)、34.97%(228/652),4剂试验组和5剂试验组不良反应发生率均低于5剂对照组(P<0.05)。局部不良反应主要为接种部位疼痛、瘙痒、肿胀和发红;全身不良反应主要为发热、乏力、头痛和肌肉痛;不良反应的严重程度均以轻度(1级)为主,分别占各组不良反应总例次数的85.33%(518/607)、89.02%(373/419)和88.96%(427/480)。三组的首针免后14 d和全程免后14 d抗体阳转率均为100%;在首针免后7、14 d和全程免后14 d,三组抗体GMC分别为0.60、0.72、0.59 IU/ml,20.42、23.99、24.38 IU/ml和22.95、23.52、24.72 IU/ml,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论该冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)按照5剂免疫程序和4剂免疫程序接种具有良好的安全性和免疫原性。

带状疱疹疫苗研究进展

带状疱疹是一种常发生于老龄人群、免疫功能低下和慢性病人群皮肤上的一种簇集型水疱病,由潜伏在神经元内的水痘-带状疱疹病毒重新激活引发。带状疱疹的持续性疼痛使患者饱受痛苦,带来严重的精神负担和经济负担。在临床药物治疗效果不佳的情况下,国外先后有减毒活疫苗和伴佐剂的重组蛋白疫苗上市,根据这两款疫苗的临床数据分析,后者已经成为美国疾病控制和预防中心推荐的首选疫苗,国内多家企业也在开展这两种疫苗的临床研究。然而,由于佐剂来源的限制,重组蛋白疫苗尚未广泛提供。随着新型冠状病毒肺炎疫情的出现,mRNA疫苗的热度也被提升,国内生物制品企业应根据国内的市场需求并结合自身发展,积极开展新型带状疱疹疫苗的研制,填补国内疫苗的空缺,增强市场竞争力。本文就目前各个疫苗平台的带状疱疹疫苗研究进展和发展做简要综述。

腺病毒载体疫苗研究进展

腺病毒不整合到宿主基因组、具有极低的插入突变风险,因此腺病毒载体广泛用作基因治疗载体。此外,腺病毒载体诱导机体产生免疫应答,有较高的热稳定性,使其成为极具潜力的疫苗载体。2019年新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的暴发使人们更加关注腺病毒载体疫苗的应用。接种疫苗仍是预防、控制包括COVID-19在内传染病最经济有效的手段,目前已开发出多种基于腺病毒载体的疫苗。本文综述了腺病毒载体基本性质、免疫机制、临床应用以及研发进展。

新一代广谱肺炎链球菌疫苗的研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)是引起全球各年龄组下呼吸道感染高发病率和死亡率的主要病原菌之一,现有的13价S.pn多糖结合疫苗(13-valent pneumococcal conjugate vaccine,PCV13)及23价S.pn多糖疫苗(23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine,PPSV23)安全性和效力良好,但存在血清型替代、年龄组覆盖不全等局限性。因此,开发能预防更多血清型S.pn感染所致疾病及中低收入国家可负担的广谱S.pn疫苗具有重要意义。基于改造S.pn毒力因子的新一代广谱S.pn疫苗正处于研发中,其中4项全细胞疫苗、15种候选蛋白疫苗已展开临床试验。本文主要就新一代广谱S.pn疫苗的研究进展作一综述。

柯萨奇病毒A组16型手足口病疫苗研究现况

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)严重影响着婴幼儿健康。肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV71)及柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病的主要病原体,曾在全球多个国家或地区暴发,接种疫苗是预防手足口病的有效途径,EV71疫苗已上市,但是CA16疫苗相关研发进展较缓慢,目前仍无相关疫苗上市。本文对CA16型灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗、DNA疫苗、重组嵌合病毒疫苗及亚单位疫苗的相关研究进展做一综述。

四价流感病毒裂解疫苗在6-35月龄婴幼儿接种的临床研究

目的评价四价流感病毒裂解疫苗(4个亚型流感病毒株血凝素各含7.5μg,规格0.25 ml/支,以下简称BY四价流感疫苗)在6~35月龄婴幼儿接种后的安全性和免疫原性。方法采用随机、双盲、平行对照设计,按1∶1∶1将河南省舞阳县2880名6~35月龄健康婴幼儿随机纳入试验组、对照组1和对照组2,每组各960人。各组受试者均按照2剂程序,间隔28 d随机接种婴幼儿四价流感疫苗、BV三价流感疫苗或BY三价流感疫苗。观察受试者接种后局部/全身不良事件和严重不良事件。免疫前和全程免疫后28 d采集外周静脉血3 ml检测各亚型流感病毒血凝素抑制(hemagglutination inhibition,HI)抗体。结果共入组2880人,各组均为960人。全程接种后30 d内,试验组未发生4级不良事件,局部、全身和总不良反应发生率分别为7.2%(69例)、39.1%(375例)、43.1%(414例)。全程接种后31~180 d,试验组和对照组1的严重不良反应(seri⁃ous adverse reaction,SAR)发生率均为0.1%(1例),对照组2未发生SAR,组间差异无统计学意义。试验组全程接种后28 d各型抗体阳转率、保护率和抗体几何平均增长倍数(geometric mean fold increase,GMI)均达到欧洲药品管理局和美国食品药品管理局制定的流感疫苗评价标准(阳转率≥30%,保护率≥60%,GMI≥2.0倍)。试验组与2个对照组进行非劣效检验,相同亚型抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)比值(95%CI)的下限均>2/3,阳转率率差(95%CI)的下限均>-10%。均满足非劣效试验假设。结论该婴幼儿四价流感病毒裂解疫苗具有较好的安全性和免疫原性,可用于6~35月龄人群的免疫接种。

四价流感病毒裂解疫苗免疫原性及安全性试验研究

目的通过动物试验评价四价流感病毒裂解疫苗的免疫原性及安全性,为临床应用提供参考依据。方法将疫苗免疫NIH小鼠,应用血凝抑制试验检测小鼠血清抗体效价,评价疫苗免疫原性,用SPSS软件对数据进行单因素方差分析;采用小鼠、豚鼠腹腔注射给药方式进行异常毒性试验;采用小鼠后肢肌肉多点注射给药方式进行急性毒性试验;采用豚鼠腹腔注射免疫和静脉给药激发方式进行全身过敏性试验;采用家兔腿部肌肉注射给药方式进行肌肉刺激试验。结果免疫四价流感病毒裂解疫苗组与免疫流感病毒裂解疫苗(三价)组小鼠间,相同采血时间,同一亚型特异性抗体效价不存在显著差异(P>0.05);异常毒性、急性毒性、全身过敏性和肌肉刺激试验均符合安全标准。结论四价流感病毒裂解疫苗与流感病毒裂解疫苗(三价)各型免疫原性上不存在差异,且具有较好的安全性。

SARS-CoV-2收获液滴度稳定性及灭活动力学分析

目的对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)收获液在2~8℃环境下的滴度稳定性及β-丙内酯灭活剂对病毒的灭活效果进行研究。方法将3批(批号:202111001、202111002和202111003)SARS-CoV-2收获液于2~8℃放置12 d,每隔3 d(0、3、6、9、12 d)取样,采用Karber法检测病毒滴度;2~8℃过夜平衡的3批病毒收获液按1∶4000的体积分数加入β-丙内酯进行灭活,在不同的灭活时间点(0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、16、24 h)取样检测病毒滴度,取灭活8.0、16、24 h的病毒液进行灭活验证,取灭活24 h的病毒灭活液进行透射电镜观察。结果2~8℃环境下,SARS-CoV-2的滴度随放置时间的延长不断降低,0~3 d滴度下降不明显,第12天滴度由最初的7.75、6和7.5 lgCCID50/mL降至5.75、4.625和6.25 lgCCID50/mL,表明2~8℃环境下病毒活力呈逐渐降低的趋势;随着灭活时间的增加,病毒滴度不断降低,灭活3 h后,病毒滴度已无法检出。透射电镜观察显示,灭活后的病毒颗粒完整,刺突蛋白分布均匀。结论2~8℃环境下保存的SARS-CoV-2毒力不稳定,应尽快进行后续的灭活纯化工艺;病毒灭活3 h后滴度已无法检出,可为灭活工艺的确定提供参考。

关于除菌滤器在线完整性测试的分析及探讨

除菌过滤系统及无菌生产工艺是保证非最终灭菌药品无菌性的重要环节。对除菌过滤系统进行使用前灭菌后完整性测试(pre-use post sterilization integrity test,PUPSIT)可确保其能有效拦截所有微生物。该研究梳理了国内外药品监管机构对PUPSIT及其节点的法规要求,分析、探讨了PUPSIT的实施利弊和行业现状,以期为药品监管机构和无菌药品生产企业提供参考。