玉米转录因子ZmMYC7对ZmLOX9的调控作用研究

为探究玉米茉莉酸(JA)信号通路中抗病关键转录因子ZmMYC7与其候选靶基因ZmLOX9的关系,本研究利用生物信息学方法对ZmLOX9的系统进化关系和启动子元件进行了分析,利用qRT-PCR技术检测了ZmMYC7基因突变对ZmLOX9基因表达的影响,并利用酵母单杂交(Y1H)技术检测了ZmMYC7对ZmLOX9启动子的结合互作。结果发现,玉米ZmLOX9与高粱SbLOX6、谷子SiLOX6等同源,ZmLOX9启动子区域含有ZmMYC7的作用元件G-box;ZmMYC7基因的突变体接种禾谷镰孢(Fusarium graminearum)后,ZmLOX9表达量显著下调;Y1H试验发现,ZmMYC7能够与ZmLOX9启动子作用,且ZmLOX9启动子区G-box是其重要作用位点。本研究结果明确了转录因子ZmMYC7直接作用于ZmLOX9启动子区G-box进而调控ZmLOX9基因的表达,为阐明转录因子ZmMYC7调控玉米抵抗病菌侵染的机制奠定了基础。

考马斯亮蓝法测定大豆水溶性蛋白提取方法的优化

为提高考马斯亮蓝法提取大豆水溶性蛋白的效率,本研究以河北省优质高蛋白大豆品种冀豆12号为材料,对考马斯亮蓝法测定大豆水溶性蛋白质含量的提取条件进行了优化。在单因素试验的基础上,通过正交试验方法分析料液比、提取温度、提取时间和转速4种因素对大豆水溶性蛋白质含量的影响,筛选出适合河北省大豆品种鉴定的精确、高效、可重复性强的方法体系,并采用优化后的提取方法测定河北省29份大豆材料的水溶性蛋白含量。结果表明:通过正交试验最终确定的优化提取条件为料液比1∶400、提取温度30℃、提取时间90 min、转速220 r·min^(-1);采用优化体系测定了2020年秋季收获的29份河北省大豆新材料的水溶性蛋白含量,其中3份材料水溶性蛋白含量为15%~20%,7份材料水溶性蛋白质含量为20%~25%,5份材料蛋白质含量为25%~30%,14份材料的水溶性蛋白质含量超过30%。

大豆单锌指蛋白基因GmSZFP的克隆及其在SMV与寄主互作中的功能

【目的】由大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一,利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能,为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征;以酵母转录激活试验检测其转录因子活性;借助实时定量PCR(RT-qPCR)验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征;结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区,序列全长为1071 bp;氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C2H2型锌指蛋白转录因子,且具有转录激活活性;RT-qPCR结果显示,GmSZFP受SMV的强烈诱导,在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同,在不亲和组合中,GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势,其表达水平明显高于亲和组合,若在接种病毒前给叶片预注射咪唑,GmSZFP的表达水平降低,并与亲和组合相近,说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H2O2信号调控;利用VIGS技术沉默GmSZFP后,发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低,RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低,胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加;在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h,病毒向外扩散至2 mm,在96 h时病毒扩散至3 mm,而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达;摩擦接种SMV后10 d,在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状,并检测到CP的表达,说明沉默GmSZFP后,SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C2H2型单锌指蛋白,GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。

病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探

为了探究大豆抵抗大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)侵染的分子调控机制,挖掘抗病相关基因,培育抗病新品种,本研究从清除H2O2前后大豆响应SMV的转录组数据库中筛选得到1个差异表达的大豆病程相关蛋白基因GmPR1-6(Glyma.15G062400.1),利用生物信息学分析并结合实时荧光定量(Real time quantitative,RT-qPCR)技术以及病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)等技术验证其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能。结果表明,GmPR1-6在非亲组合中转录水平的表达量显著高于亲和组合;GmPR1-6基因沉默植株叶片接种SMV的部位胼胝质积累面积增大、胼胝质荧光强度减弱,病毒在胞间扩散的能力增强,说明GmPR1-6基因在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。研究结果为进一步探究病程相关蛋白在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能提供试验依据。

小麦TaTCTP蛋白的原核表达及抗体制备

为了阐明翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)在小麦-叶锈菌互作中的作用及其机制,本研究克隆了TaTCTP的开放阅读框(ORF)全长,并经过原核表达、亲和纯化、动物免疫,制备了TaTCTP兔多克隆抗体。结果表明,该基因CDS区全长为507 bp,编码168个氨基酸,预期分子量为18.8 kD,并具有较高的可溶性。以纯化后的TaTCTP重组蛋白制备的抗体可以特异性识别TaTCTP,效价为1∶6400。Western blotting检测发现TaTCTP在叶锈菌侵染后受诱导上调。本研究为进一步研究TaTCTP在小麦与叶锈菌互作过程中的功能及其作用机制奠定了基础。

灰葡萄孢Bromodomain转录因子家族成员鉴定及表达分析

为了解灰葡萄孢Bromodomain转录因子家族成员的功能,本研究利用生物信息学方法对灰葡萄孢Bromodomain转录因子家族成员进行理化性质、染色体定位、系统发育、基因结构、保守结构域以及分生孢子发育时期及侵染时期的表达规律分析;并利用qPCR技术检测灰葡萄孢Bromodomain家族基因在NaCl和刚果红处理后的表达变化。结果显示,灰葡萄孢中包含8个Bromodomain家族基因,系统发育分析将它们分为4个亚家族,Bromodomain家族基因在分生孢子的不同发育和侵染时期呈现不同的表达规律,在NaCl和刚果红处理后都呈现下调表达,表明了Bromodomain家族基因在灰葡萄孢生长发育、侵染植物以及胁迫应答过程中可能具有重要的功能。本研究为深入探讨Bromodomain转录因子家族基因的功能和灰葡萄孢的防治奠定基础。

玉米组蛋白编码基因鉴定与表达分析

为了鉴定玉米基因组中组蛋白编码基因并分析其在不同条件下的表达规律,本研究利用生物信息学方法对玉米基因组中组蛋白编码基因进行了系统性鉴定和分析,利用同源性分析鉴定玉米组蛋白编码基因,利用保守结构域分析对组蛋白进行结构域鉴定,利用转录组测序数据对组蛋白编码基因进行表达规律分析。结果表明,玉米基因组中存在16个H2A,13个H2B,12个H3,9个H4和4个H1;对蛋白结构分析时发现玉米组蛋白保守结构域的数量和序列在同一亚族中高度保守,并且在不同物种中也非常保守;对玉米组蛋白基因的组织表达特异进行分析,发现玉米组蛋白编码基因在不同组织中表达水平有明显差异;对生物胁迫和非生物胁迫数据分析,发现组蛋白编码基因在不同胁迫下表达水平发生明显变化。本研究全基因组层面对玉米组蛋白编码基因进行了系统性鉴定和分析,明确了玉米中组蛋白的编码基因,揭示了组蛋白编码基因在玉米不同组织及生物和非生物胁迫中的表达规律,为进一步阐明其功能奠定了重要的理论基础。

小麦富含半胱氨酸的类受体激酶TaCRK2与翻译控制肿瘤蛋白TaTCTP的相互作用

TaCRK2在叶锈菌侵染小麦诱发的过敏性反应中起正调控作用,为深入了解TaCRK2在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用机制,本试验采用串联亲和纯化与质谱联用(TAP-MS)技术,鉴定出翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)为TaCRK2的潜在互作蛋白。但TaCRK2与TaTCTP的相互作用还缺乏试验证据,本研究利用DUALmembrane系统酵母双杂交(DUALmembrane system yeast-twohybrid)和双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术验证TaCRK2和TaTCTP之间的相互作用。DUALmembrane系统酵母双杂交结果显示,同时携带TaCRK2和TaTCTP的酵母NMY51可以在缺陷型培养基上生长;BiFC试验结果显示,TaCRK2和TaTCTP发生相互作用,并且定位在烟草表皮细胞的内质网膜上。本研究为深入了解TaCRK2在叶锈菌侵染小麦诱发的过敏性反应中的作用机制奠定了基础。

小麦与叶锈菌互作过程中TaSnRK1的表达分析及其亚细胞定位

本研究选用叶锈菌生理小种260,与小麦近等基因系Tc Lr26及其轮回亲本Thatcher (Tc)分别组成不亲和组合和亲和组合,在7日龄小麦叶片上接种叶锈菌,采用实时定量PCR(RT-qPCR)对TaSnRK1基因的表达进行分析。并通过构建pSuper1300+-SnRK1表达载体对TaSnRK1进行亚细胞定位分析。由RT-qPCR结果可知,该基因在不亲和组合中,表达量随时间延长先升高后下降,且在12 h达到峰值;而在亲和组合中,表达量也呈现先升高后下降趋势,但表达量远远低于不亲和组合。亚细胞定位结果表明,TaSnRK1蛋白分布在细胞质和细胞核中。本研究结果为进一步深入探讨TaSnRK1的功能和作用机制奠定了基础。

TaCDPK6在小麦与叶锈菌互作过程中的表达模式分析

为了深入探究钙依赖蛋白激酶(Calcium dependent protein kinase,CDPK)在小麦与叶锈菌互作过程中的功能机制,本试验结合叶锈菌生理小种260侵染小麦品种Tc Lr26后的RNA-seq数据和NCBI基因组数据筛选得到抗病相关基因TaCDPK6,并对TaCDPK6进行了蛋白质理化性质分析;利用RT-qPCR和Western blotting技术检测TaCDPK6基因及其表达蛋白在小麦与叶锈菌互作过程中的表达模式。结果表明,TaCDPK6蛋白分子大小为57 kD,理论等电点为7.61,为亲水性蛋白质;在小麦叶片接种叶锈菌后,随着接种时间的延长,目的基因及蛋白呈先上升后下降的表达趋势,并且在4~8 h表达量达到最高,与RNA-seq数据分析得到的表达趋势基本一致。结果表明TaCDPK6在小麦抵抗叶锈菌的基础防御反应中可能发挥正调控作用。

玉米大斑病菌小柱孢酮脱水酶StSCD家族鉴定及其功能分析

【目的】小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)小柱孢酮脱水酶基因(StSCD)家族,并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响,为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据,获得StSCD基因家族的全序列,并与玉米小斑病菌(Cochlibolus heterostrophus)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、瓜类炭疽病菌(Colletotrichum lagenaria)等真菌的SCD进行序列比对;收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析,获得不同时期、不同StSCD的表达量,从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因;使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌,测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等,确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD,其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性,StSCD4与多主棒孢(Corynespora cassiicola)中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现,在附着胞时期4个StSCD表达量均上调,其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著,附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降,并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后,黑色素合成受阻,附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD,推测StSCD4参与DHN(1,8-间苯二酚)黑色素的合成,并进而影响附着胞膨压积累。

过氧化氢酶BcCAT2在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能初探

为了明确灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2在病菌生长发育时期和侵染过程中的功能,本研究利用生物信息学方法,对BcCAT2及其编码蛋白进行分析;构建了BcCAT2敲除载体,利用原生质体转化方法,获得了BcCAT2敲除突变体;利用PCR和qRT-PCR技术,对所获得的转化子进行鉴定;对野生型菌株和△Bccat2的表型(菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等)和致病力进行分析。结果发现,BcCAT2基因的缺失会导致菌丝形态纤细、生长速度缓慢、几乎不产菌核和分生孢子,且致病力明显下降,表明BcCAT2基因正调控病菌的生长发育和致病力。研究结果为进一步阐明灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。

TaNPR1在小麦抵抗叶锈菌过程中的作用

叶锈病是一种影响小麦(Triticum aestivum)产量的重要病害,挖掘广谱有效的抗病基因有利于促进小麦品种改良。NPR(Nonexpressor of pathogenesis-related genes,NPR)是一类具有广谱抗病作用的关键因子,本研究分析了TaNPR1在抵抗叶锈菌过程中的功能。通过qRT-PCR(quantitative Real-time-Polymerase Chain Reaction)检测,亚细胞定位观察,VIGS技术沉默TaNPR1后试验,表明TaNPR1影响寄主HR(Hypersensitive reaction)的产生,在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中发挥正调控作用。

在小麦和叶锈菌互作过程中TCTP的表达特征

翻译控制肿瘤蛋白是调节植物生长发育、参与植物抵抗逆境胁迫的重要调节因子。本研究以叶锈菌生理小种260与4种含有不同抗叶锈基因的近等基因系分别组成亲和程度不同的组合为对象,采用RT-qPCR和Western Blotting方法,从转录和翻译两个水平探讨TCTP在小麦与叶锈菌互作过程中的表达模式。研究结果表明,无论是转录水平还是翻译水平上,TCTP在不亲和组合中均表现为表达量显著上调,但在不同的Lr基因背景下其表达模式有所不同;而在亲和组合中并未表现出明显的变化趋势。基于TCTP mRNA和蛋白水平的结果,发现在小麦与叶锈菌互作体系中TCTP在转录水平和翻译水平均受到调控,推测其在小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应中可能发挥正调控作用,这将为进一步研究TCTP的功能及其作用机制奠定了基础。

玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1992 bp,开放阅读框为2352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。

玉米CaM基因家族鉴定及特性分析

利用玉米基因组等多种数据库搜索CaM家族基因,对玉米CaM基因家族进行筛选与鉴定,对家族成员的基因结构、等电点、分子量、亚细胞定位、蛋白保守域等蛋白基本特性进行分析。同时分析不同组织和干旱胁迫条件下该类基因的表达情况,进一步利用qRT-PCR技术检测5个具有代表性的CaM基因在干旱处理条件下的表达变化。结果显示,共获得14个CaM基因,根据3’-UTR序列构建的系统进化树显示可分为4个亚家族。根据蛋白质的氨基酸序列,可分为3种亚型。家族成员蛋白分子量大多数为16.8 kD左右,等电点介于4.10~4.30,该家族蛋白保守结构域由3~4个EF手型结构域组成,主要定位于细胞质和细胞核。Zmcal4、Zmcal5和Zmcal6基因在各组织中表达非常低,干旱会抑制家族大部分成员的表达,覆水处理后,Zmcal3-1、Zmcal3-2、Zmcal3-3、Zmcal3-4的表达可恢复到对照水平,推测这几个基因可能参与干旱胁迫反应。qRT-PCR结果表明,干旱会抑制CaM基因的表达,随着干旱处理时间的增加,CaM基因的表达量逐渐降低,与生信分析结果一致。