携带BARF1基因的重组巨细胞病毒的构建

目的依据细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)能够克隆大段DNA病毒的特点,通过galk为基础的同源重组,将EB病毒编码BARF1基因插入巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV),构建重组病毒。方法 PCR扩增带有巨细胞病毒UL57基因左右同源臂的galk及BARF1基因片段,经过电转化,进行同源重组,经含有galk培养基及脱galk培养基筛选,获得带有BARF1的巨细胞病毒细菌人工染色体克隆,提取质粒,转染到ARPE-19细胞,观察带有BARF1基因的巨细胞病毒对ARPE-19细胞的影响。结果感染带有BARF1基因的巨细胞病毒的ARPE-19细胞形态由原来的长梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多,并且细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象。结论建立了携带BARF1基因的重组巨细胞病毒;同时表明利用细菌人工染色体,可方便地对病毒基因组进行准确操作。

部分植物性天然产物在非酒精性脂肪肝中的研究进展

非酒精性脂肪肝疾病(Non-alcoholicfatty liverdisease,NAFLD)是一种严重的慢性代谢性疾病,也是当今世界范围内慢性肝病最常见的病因之一,其特征是肝实质细胞中脂肪堆积增加[1],发病机制复杂,通常与氧化应激、炎症和胶原纤维组织以及胰岛素抵抗密切相关。进行性NAFLD从简单的脂肪堆积发展为非酒精性脂肪性肝炎,进而形成肝胶原纤维组织,最后发展为肝硬化,成为导致肝移植最常见的肝脏疾病[2]。

肺鳞状细胞癌预后相关miRNAs及其候选靶基因生物信息学筛选

目的筛选与肺鳞状细胞癌预后相关的miRNAs及其靶基因的预测。方法采用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库收集人肺鳞状细胞癌miRNAs表达数据并进行差异表达分析;采用Kaplan-Meier分析差异表达的miRNAs与患者生存率的相关性;单因素方差分析差异表达的miRNAs与淋巴转移的相关性;采用DIANA TOOLS v5.0生物信息网站对筛选出的差异表达的miRNAs进行靶向基因预测、GO和KEGG功能富集分析;通过miRDB、miRwalk、TargetScan和microRNAs.org数据库进一步预测与预后相关性较高的miRNAs的靶基因;利用GEPIA在线工具评估miR-30a-3p候选基因的临床预后意义;候选靶基因与miR-30a-3p的相关性采用Pearson相关性分析。结果按照logFC>2、P<0.05标准筛选出差异表达显著的miRNAs共201个(173个上调、28个下调);其中下调的miR-144-5p、miR-30a-3p及上调的miR-210-3p、miR-9-5p与肺鳞状细胞癌患者生存率相关,且下调的miR-30a-3p与淋巴转移相关(P<0.05);miRDB、miRwalk、TargetScan和microRNAs.org数据库共同筛选出53个miR-30a-3p候选靶基因;高表达的USP38、SLMAP与更差的OS显著相关(P<0.05)。miR-30a-3p与RCN2、C8orf44和NAA25的表达量呈显著负相关(P<0.001)。结论miR-30a-3p可能通过负调控靶基因USP38、SLMAP、RCN2、C8orf44和NAA25参与肺鳞状细胞癌的发生发展过程,有望作为肺鳞状细胞癌预后相关分子标记物。

MicroRNA-105-5p/PPM1A对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究

目的探讨microRNA-105-5p(miR-105-5p)/PPM1A对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭及上皮细胞向间质转化(EMT)进程的影响及其潜在作用机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-105-5p在人胰腺导管上皮细胞hTRET-HPNE和胰腺癌细胞PANC-1、AsPC-1、Bxpc-3中的表达。利用Kaplan-Meier Plotter在线工具探讨miR-105-5p与胰腺癌患者预后的关系。在PANC-1细胞中分别转染mimic NC、miR-105-5p mimic、inhibitor NC、miR-105-5p inhibitor。CCK-8法、划痕实验、Transwell实验分别检测各组细胞的增殖、迁移及侵袭能力;qRT-PCR检测miR-105-5p对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1表达的影响。生物信息学方法预测miR-105-5p的候选靶基因,并对候选靶基因进行GO和KEGG富集分析。双萤光素酶实验检测miR-105-5p与PPM1A的靶向关系。qRT-PCR检测在PANC-1细胞中分别转染mimic NC、miR-105-5p mimic、inhibitor NC、miR-105-5p inhibitor后PPM1A的表达。免疫荧光实验检测PPM1A在人胰腺导管上皮细胞hTRET-HPNE和胰腺癌细胞PANC-1、AsPC-1、Bxpc-3中的表达。在PANC-1细胞中分别转染mimic NC+pcDNA3.1、mimic NC+pcDNA3.1-PPM1A、miR-105-5p mimic+pcDNA3.1-PPM1A后,通过挽救实验进一步研究miR-105-5p inhibitor与PPM1A在胰腺癌细胞中的相互作用关系。结果胰腺癌细胞PANC-1、AsPC-1、Bxpc-3中miR-105-5p mRNA相对表达量高于hTRET-HPNE细胞中miR-105-5p mRNA相对表达量(P<0.05),以PANC-1细胞中的相对表达量最高。miR-105-5p高表达与胰腺癌患者的不良预后有关(P<0.05)。miR-105-5p mimic组细胞增殖、迁移及侵袭能力均高于mimic NC组(P<0.05)。与mimic NC比较,miR-105-5p mimic下调E-cadherin mRNA表达,上调N-cadherin、Vimentin、ZEB1 mRNA表达(P<0.05)。转染miR-105-5p inhibitor后得到相反的结果。双萤光素酶实验证实miR-105-5p与PPM1A存在靶向关系。免疫荧光实验显示在胰腺癌细胞PANC-1、AsPC-1、Bxpc-3中PPM1A的荧光强度低于人胰腺导管上皮细胞hTRET-HPNE(P<0.05)。挽救实验表明miR-105-5p可部分挽救PPM1A对PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P<0.05)。结论miR-105-5p靶向PPM1A促进胰腺癌PANC-1细胞的增殖、迁移及侵袭。