广东地区犬瘟热病毒血凝素基因的克隆与序列分析

【目的】对广州和东莞市宠物犬感染犬瘟热病毒(CDV)的情况进行病原鉴定和分析,为监测CDV的遗传变异情况和防治犬瘟热(CD)提供数据基础。【方法】从表现CD症状的犬只中鉴定了17份CDV阳性样本,采用RT-PCR的方法克隆得到这些野毒株的血凝素(H)基因序列,采用生物信息学方法进行序列比对分析。【结果】17株CDV的H基因核苷酸与氨基酸序列的相似性分别为97.4%~100.0%和97.5%~100.0%,与Onderstepoort、Lederle和Convac等疫苗株相比,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为90.3%~91.5%和89.4%~90.8%。进化树分析结果显示,17株CDV野毒株均属于AsiaⅠ型,与疫苗株的分支较远;本研究鉴定的野毒株已进化形成9个潜在的N-糖基化位点。【结论】AsiaⅠ型CDV仍为该地区的流行基因型,基因型较稳定,但与疫苗株相比形成了一定的进化距离和出现了大量的变异。因此,继续监控CDV在犬群中的进化,掌握其遗传变异状况具有重要意义。

牛流行热病毒可视化RT-LAMP检测技术的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、简便、可视化地检测牛流行热病毒的分子生物学方法。【方法】根据牛流行热病毒G蛋白基因的6个保守区域设计2对引物,建立牛流行热病毒可视化逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术,优化RT-LAMP的反应条件,将其与PCR方法进行比较。【结果】当Mg2+浓度为3 mmol·L^(-1)、甜菜碱浓度为0.4 mol·L^(-1)、d NTPs mix浓度为1.2μmol·L^(-1)、内外引物浓度比例为8∶1、反应温度为63℃时,反应梯形条带最明显,在反应40 min后可以观察到明显的梯形条带。建立的RT-LAMP检测方法特异性好,只对牛流行热病毒进行扩增;灵敏度比普通PCR高10倍。【结论】该方法操作简便,特异性强,结果判读方便,可用于牛流行热的快速检测。

猫传染性腹膜炎的诊治

通过对一例疑似猫传染性腹膜炎病例进行较详细的临床检查、影像学检查、血液学检查和腹水检查后,对患猫进行剖腹探查手术,将腹腔肿块进行组织病理学和冠状病毒检测,最后确诊为猫传染性腹膜炎。此外对相关资料进行回顾,以加深对猫传染性腹膜炎的症状、诊断、治疗和转归的了解,为以后的临床诊疗提供参考。

广州地区猫泛白细胞减少症病毒分离鉴定及全基因组遗传分析

【目的】分析广州地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPLV)的自然重组、跨宿主传播以及流行变异情况。【方法】采集疑似感染猫泛白细胞减少症病毒的猫粪便样品进行细胞分离,并对阳性病料提取基因组DNA,PCR扩增获得病毒的全基因组序列,并与Gen Bank中相关的参考毒株序列进行遗传进化分析,同时对VP2基因与NS1基因的主要氨基酸位点进行差异分析。【结果】成功获得2株猫泛白细胞减少症病毒及其全基因组序列。遗传进化分析显示,广州地区分离的猫泛白细胞减少症病毒FPLV-GZ01、FPLV-GZ02与我国其他分离毒株FPLV-XJ01、FPLV-HRB属同一分支,提示FPLV-GZ01、FPLV-GZ02由FPLV-XJ1进化而来;NS1基因系统进化树显示,FPLV存在与CPV-447重组的可能。主要氨基酸位点分析显示,FPLV在VP2基因中的主要氨基酸位点上的遗传变异比CPV保守;在NS1基因上发现FPLV-GZ01、FPLV-GZ02分别存在不同程度的氨基酸位点突变。【结论】广州地区分离的猫泛白细胞减少症病毒仍在不断地重组进化。

长链非编码RNA NEAT1通过Wnt/β-catenin信号通路影响PRRSV复制机制的初步研究

长链非编码RNA(LncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,对于调节多种生命活动发挥着重要作用。为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与LncRNA核富集转录体1(NEAT1)相互作用的分子基础,本研究将PRRSV(MOI 1)感染Marc-145细胞,分别在感染后不同时间(0、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、60 h、72 h)收集细胞,提取细胞总RNA,反转录为cDNA,利用qRT-PCR方法检测PRRSV对Marc-145细胞内NEAT1转录的影响,结果显示:PRRSV感染显著上调Marc-145细胞内NEAT1的转录水平(p<0.001);将不同MOI(0.1、0.5、1、2)PRRSV感染Marc-145细胞48 h后收集细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测PRRSV对Marc-145细胞内NEAT1转录的影响,结果显示,不同MOI的PRRSV对NEAT1的转录水平影响不显著;将PRRSV(MOI 1)感染Marc-145细胞48 h后,采用RNA荧光原位杂交(RNAscope)方法检测PRRSV感染对NEAT1在Marc-145细胞内分布的影响,结果显示,NEAT1定位于Marc-145细胞核,PRRSV感染诱导核内NEAT1的转录水平上调(p<0.01);将NEAT1-C0、C1、C2、C3、C4、C5和C6分别转染Marc-145细胞12 h后,接种PRRSV(MOI 0.1)24 h,采用q RT-PCR方法检测NEAT1各个片段对PRRSV复制的影响,结果显示,NEAT1各个片段过表达均可抑制PRRSV ORF7 mRNA的转录,其中C4区域的抑制效果最佳(p<0.001);将NEAT1-C4转染Marc-145细胞36 h,采用q RT-PCR方法检测NEAT1-C4对细胞因子分泌的影响,结果显示,过表达NEAT1-C4上调Marc-145细胞内IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10、细胞性骨髓瘤病病毒癌基因(c-myc)和细胞周期蛋白1(cyclinD1)的转录水平(p<0.001);将TOP、NEAT1-C4和PGL4.74共转染Marc-145细胞36 h,同时将FOP、C4和PGL4.74共转染Marc-145细胞作为对照,利用双荧光素酶报告基因方法检测NEAT1-C4对Wnt/β-catenin通路活性的影响,结果显示,过表达NEAT1-C4显著增加LEF1/TCF转录因子的转录活性(p<0.01),及诱导Wnt/β-catenin通路的活化。上述结果首次证实了LncRNA NEAT1通过C4段区域上调Marc-145细胞内Wnt/β-catenin信号通路的活性从而抑制PRRSV的复制。本研究为探究PRRSV与宿主之间的相互作用及PRRSV致病机制提供参考依据。

基于B646L、EP402R、MGF360/505基因的非洲猪瘟病毒ERA检测方法的建立

【目的】建立一种基于酶促重组酶扩增(Enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)DNA快速检测方法。【方法】参考ASFV B646L基因、EP402R基因和多基因家族成员MGF360/505基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立42℃等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。【结果】ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF3个检测方法分别在16、7和13 min内即可得出检测结果;特异性强,对阳性样品拷贝数的检测下限均为102μL-1;与我国非洲猪瘟诊断技术标准中的方法对比,结果符合率为100%。【结论】本研究建立的ERA检测方法可以用于ASFV的快速检测,为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。

犬流感病毒重组核蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立H3N2亚型犬流感病毒（cIv）血清学检测方法，本研究利用H3N2亚型CIV重组核蛋白（rNP）作为检测抗原，通过优化反应条件，建立了检测CIV核蛋白血清抗体的间接ELISA方法。通过检测10份SPF犬血清样品确定阴阳性临界值为0．288。该方法检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感毒、犬腺病毒II型、狂犬病病毒、犬弓形虫、犬弓首蛔虫、犬复孔绦虫的阳性血清均为阴性，具有良好的特异性，但与H1N1、H3N8和H9N2亚型CIV有交叉反应。该方法检测H3N2CIV血清抗体的灵敏度为血凝抑制试验（HI）的3～12．5倍；而且其批内批间变异系数为1．85％～6．57％，重复性良好。通过对H3N2CIV攻毒犬血清进行分析，表明该检测方法具有滞后性，检测到CIV抗体的时间晚于HI试验。利用本研究建立的方法和以H3N2CIV为诊断抗原的HI检测方法对450份血清样品进行检测，结果显示该方法对血清样品具有初筛作用，两者阳性符合率为58-3％，阴性符合率为100％。本研究可以结合其它血清学方法为CIV流行病学调查进行快速、高效的检测。

白狐源星状病毒RdRp基因的鉴定及遗传演化分析

【目的】探究广州动物园一例死亡白狐Alopex lagopus肾脏中鉴定出的星状病毒的遗传变异情况。【方法】对死亡白狐进行剖检,利用半巢式RT-PCR对内脏器官进行病原学检测,对扩增出的病毒株的RdRp基因序列进行相似性分析。【结果】死亡白狐的肾脏苍白肿大,被膜难以剥离,肾脏中检测出的星状病毒RdRp基因呈阳性。RdRp基因与9株参考毒株的核苷酸相似性为67.5%~96.2%,其中与香港猫源星状病毒1637F的核苷酸相似性(96.2%)最高。【结论】本研究为星状病毒在野生哺乳动物间的跨种传播及肠外器官中的感染提供了依据。

牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的调控机制

[目的]研究牛分枝杆菌Mycobacterium bovis PtpA蛋白对免疫应答相关的NF-κB信号通路的影响,以揭示PtpA蛋白在机体免疫应答中的作用。[方法]构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA,并将其转染到HEK293T中,进行SDS-PAGE分析及Western blot检测。激活NF-κB信号通路后,通过双荧光素酶试验和qPCR方法探究PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响。[结果]成功构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA,转染HEK293T后经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为22 000处可见特异性蛋白条带。Western blot结果显示,表达产物可与一抗特异性结合,证明该蛋白是PtpA蛋白。双荧光素酶试验中,转染2~24 h,试验组与对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光强度的比值差异显著(P<0.05);转染2 h后,对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光值是试验组的2.93倍,说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活早期具有显著的抑制作用。qPCR结果显示,转染2 h后,对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的3.93、3.42、2.17和2.30倍(P<0.01);转染4 h后,对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的4.26、3.93、2.36和2.50倍(P<0.01),说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路相关的细胞因子(IL-6、GM-CSF、BIRC-2、BIRC-3)在免疫早期具有显著抑制作用。[结论]qPCR结果与双荧光素酶试验结果一致,表明牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响主要发生在早期。本研究为后续研究有效的结核病防控药物提供了理论基础。

D型流感病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立一种可以快捷、灵敏、安全地检测D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)的实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)方法,试验首先将IDV NP基因作为检测目标,根据其序列的保守区设计了一对RT-qPCR引物,然后采用单一变量法对RT-qPCR反应条件中的引物浓度和退火温度进行优化,建立了一种可检测IDV的RT-qPCR方法,并对该方法的灵敏度、重复性和特异性进行检测,最后应用该方法进行临床样本检测。结果表明:所建立的RT-qPCR方法的最佳引物浓度和退火温度分别为400 nmol/L和61℃,标准曲线为y=-3.572x+42.02(R^(2)=0.9993);该方法能检测到的最低拷贝数为8.30×10^(1)copies,灵敏度是常规PCR的100倍左右;组内重复和组间重复变异系数(CV)值均小于3%;同时检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛疱疹病毒4型(BHV-4)和牛流行热病毒(BEFV)的结果均为阴性;应用该方法对收集到的244份有呼吸道症状的牛鼻拭子样品进行检测,阳性率为1.23%。说明成功建立了IDV RT-qPCR检测方法,该方法具有灵敏度高、重复性和特异性好的特点,为IDV的防控提供了可靠的技术支撑。

反刍动物消化道三位点瘘管的手术安装及体会

为了研究反刍动物的营养代谢及饲料的转化利用率，笔者先后对2头奶牛及10只奶山羊进行了永久性瘤胃、十二指肠以及回肠末端三位点瘘管的手术安装。经悉心护理，术后瘘管安装处创口愈合良好，手术成功率较高，能够满足科研需求。

SOD对比格犬全血保存作用的研究

在现代医学中，输血是常用的急救和治疗措施。保存血液的质量好坏直接影响输血治疗的效果。在血液保存过程中会产生大量氧自由基，破坏红细胞表面的脂质和蛋白造成红细胞氧化损伤。马恩普等将超氧化物歧化酶（SOD）作为抗氧化剂溶入GMA保存液中对人全血进行保存，结果表明，能延长血液保存时间。M．Jowik等研究发现，用枸橼酸磷酸葡萄糖腺嘌呤（CPDA）保存液保存人全血，随着保存时间的延长红细胞SOD含量呈下降趋势。

一例猫黏液炎性纤维母细胞肉瘤的病理学诊断

笔者针对1例猫脾脏增生病例,采用X射线检查、大体观察、病理组织学诊断等检测方法,结合文献对其进行确诊。结果表明:该增生组织呈结节状生长,局部有黏液样变性,增生细胞体积大、异型性明显,易见核分裂相,最终诊断为疑似黏液炎性纤维母细胞肉瘤。鉴于彻底剥离该肿物难度较大,采取将脾脏整体切除的方法治疗,以降低其对机体的影响。