猪源致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及抗菌药耐药性的调查

【目的】探讨猪大肠杆菌病分离的E.coli的优势血清型与毒力基因和耐药性的相关性。【方法】采用玻片凝集法测定了猪大肠杆菌病有关的血清型分布,PCR方法调查7种毒力相关基因,用微量稀释法测定了所有菌株对18种抗菌药的敏感性。【结果】超过一半的菌株含有astA,Stx2e和eaeA基因,且毒力基因组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行。定型菌株53株,分别属于15个不同的血清型,其中O8和O64为主要流行的血清型。O8型菌株中,所有均携带astA基因,多数耐四环素、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑,但对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感;而O64型菌株中,多数携带astA和Stx2e基因,所有对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑耐药,但对多黏菌素E和卡那霉素敏感。【结论】O8和O64为主要流行的血清型,两种血清型菌株拥有相似的毒力基因谱和耐药表型,但有不同的敏感表型。

液相色谱-质谱联用检测牛奶中氟喹诺酮类药物残留的确证方法

【目的】建立牛奶中诺氟沙星、氧氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等10种氟喹诺酮类药物残留检测的液相色谱-大气压化学电离-离子阱质谱确证方法。【方法】牛奶经三氯乙酸和乙腈沉淀蛋白、聚合物反相Strata-X固相萃取柱净化、ODS2分离后,用大气压化学电离-离子阱质谱测定。【结果】对诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星等5种药物进行了定量方法学验证:在1.0～100.0ng·ml-1范围内线性良好(r>0.99);以1.0、10.0、100.0ng·ml-1浓度水平的添加回收率为60.6%～101.0%,日内变异系数≤17.5%,日间变异系数≤22.1%;检测限为0.2～0.8ng·ml-1,定量限为0.8～2.8ng·ml-1。【结论】此方法为一种检测氟喹诺酮类药物在牛奶中残留的高通量确证分析方法。

动物、环境及饲养员多重耐药大肠杆菌的PFGE分型研究

目的了解养殖场多重耐药大肠杆菌耐药性的传播机制,探讨人、动物与环境间耐药菌垂直克隆传播的可能性。方法采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法对分离自养殖场动物、环境和饲养员的86株耐药谱相近多重耐药大肠杆菌进行DNA指纹图谱分型,比较菌株之间的亲缘关系。结果37株鸡场来源大肠杆菌可分为20种PFGE分型;49株猪场来源大肠杆菌可分为24种PFGE分型;同一动物、环境或饲养员采样点分离菌株PFGE指纹图谱相同者较多;同一养殖场不同动物个体、养殖场环境不同采样点、动物和环境以及饲养员和环境都存在PFGE指纹图谱完全相同菌株;鸡场和猪场都发现有属同一PFGE分型的来自动物、饲养员和环境的菌株;86株菌全部对环丙沙星、氨苄西林、链霉素、四环素、多西环素和复方新诺明耐药,相同PFGE分型的菌株其耐药谱型不一定相同。结论养殖场动物、环境及饲养员之间存在多重耐药大肠杆菌的克隆传播。

鸡源肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因检测

【目的】对广东地区分离得到的鸡源肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因检测。【方法】采用纸片扩散法对84株鸡源肠杆菌临床分离株进行27种抗菌药物的敏感性测定。通过PCR检测质PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr。研究PMQR基因阳性菌株染色体gyrA、gyrB、parC、parE基因喹诺酮耐药决定突变区(QRDRs)的变异情况。【结果】84株鸡源肠杆菌对兽医临床常用的恩诺沙星、氟罗沙星、氨苄西林、复方新诺明、强力霉素以及利福平、链霉素、罗红霉素的耐药率很高,且为多重耐药;对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、多粘菌素E和头孢氨苄的敏感性高。在84株鸡源肠杆菌中检测到1株同时携带qnrB和aac(6′)-Ib-cr基因的肺炎克雷伯氏杆菌GDK05,整个qnrB基因的阅读框架与GenBankTM中的qnrB6一致,同时GDK05在gyrA基因的QRDR出现83位S→I变异,gyrB、parC、parE基因的QRDRs没有检测到变异。【结论】广东地区集约化养殖场鸡源肠杆菌对兽医临床常用抗菌药物耐药严重。本研究首次在兽医临床上检测到1株同时携带qnrB6和aac(6′)-Ib-cr基因的鸡源肺炎克雷伯氏菌。PMQR机制的出现预示着喹诺酮类耐药很可能会在兽医临床上更加快速而广泛地传播。

宠物源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因流行性检测

【目的】对广州分离得到的宠物源(主要是宠物猫、狗)大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因的流行性检测。【方法】采用琼脂平板稀释法对164株临床分离的宠物源大肠杆菌进行15种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。通过PCR检测qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因。建立大肠杆菌基因指纹图谱并对指纹图谱进行分析。【结果】164株宠物源大肠杆菌对12种兽医临床常用抗生素耐药率较高,且表现为多重耐药(5-14耐)。在164株宠物源大肠杆菌中检测到3个菌株同时携带qnrA、qnrB和qnrS基因,其中2株也携带aac(6′)-Ib-cr基因。阳性菌株均能扩增出指纹图谱,具有两个以上PMQR基因的菌株多分布于B型和C型。【结论】广州市宠物源大肠杆菌对临床常用抗菌药物耐药较为严重,检测结果显示喹诺酮类耐药基因在本市宠物医学临床上传播广泛,PMQR基因的产生能力与其基因型有密切的关系。

猪阴沟肠杆菌16SrRNA甲基化酶耐药基因分析

【目的】分析猪阴沟肠杆菌GZL41B中4种质粒介导的16SrRNA甲基化酶耐药基因及其水平传播方式;【方法】采用PCR及序列分析方法检测鉴定猪阴沟肠杆菌中16SrRNA甲基化酶耐药基因。以大肠杆菌E.coli Rif+488(耐利福平)为受体菌进行接合试验研究16SrRNA甲基化酶耐药基因的水平传播方式。用微量稀释法测定原菌株及其接合子对18种抗菌药物的敏感性。用PCR及序列测定法分析比较来自同一猪腹泻直肠拭子阴沟肠杆菌GZL41B和大肠杆菌GZL41H的侧翼序列并对172株动物源大肠杆菌中16SrRNA甲基化酶耐药基因流行情况进行调查。【结果】从阴沟杆菌中成功扩增出目的片段,该片段经限制性内切酶HindⅢ酶切后,出现与预期的531 bp和194 bp相符的两段片段,序列测定结果证实该基因为rmtB,GenBank登录号为EF017943。以E.coli Rif+488(耐利福平)为受体菌,成功地获得了接合子,该接合子经鉴定为大肠杆菌。原菌株和接合子对卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、西梭米星、萘替米星、庆大霉素等4,6-二脱氧链霉胺类高度耐药,其MIC均≥256μg.mL-1。大肠杆菌GZL41H中,rmtB的上游为Tn3转座子的部分序列,下游为肠炎沙门氏菌基因岛SGI1上融合酶编码基因groEL/intI1的部分序列orf1,而来源相同的阴沟肠杆菌GZL41B未扩增到与大肠杆菌GZL41H相同的侧翼序列。172株动物源大肠杆菌中,25株菌(15%)检出rmtB,1株菌(0.6%)检出armA;【结论】16SrRNA甲基化酶耐药基因rmtB首次出现在猪阴沟肠杆菌中,该基因介导猪阴沟肠杆菌对4,6-二脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素的高度耐药,并能通过接合方式在不同种属细菌间进行传播。rmtB在阴沟肠杆菌和大肠杆菌中传播的遗传背景存在差异。动物源大肠杆菌中rmtB广泛流行。

宠物源大肠杆菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrD的研究

【目的】对临床分离的宠物源大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrD的检测,并对该基因进行序列分析和传播机制的研究。【方法】采用微量稀释法对阳性菌株进行15种抗生素的最小抑菌浓度试验;通过PCR对基因克隆,并对克隆产物和菌株阳性质粒进行转化;同时对菌株进行接合转移试验。【结果】从164株宠物源大肠杆菌中检测出1株qnrD阳性菌株(GP2009-036),GP2009-036对14种兽医临床常用抗生素耐药严重,表现为多重耐药(14耐);PCR产物经连接PMD19-T载体后可转化入DH5α感受态细胞中;接合转移试验成功地将质粒转移到大肠杆菌J53中;可从GP2009-036与其转化子中抽提出阳性质粒。【结论】该qnrD阳性菌株对临床常用抗生素耐药严重,且阳性质粒可在病原微生物间进行水平传播,其水平传播机制可能使该基因在宠物临床上进行传播。

养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究

目的探讨从养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌的gyrA和parC基因突变特征。方法用琼脂稀释法测定环丙沙星和恩诺沙星对菌株的最小抑菌浓度。PCR扩增gyrA和parC基因的喹诺酮耐药决定区,扩增的片段长度分别为525bp和487bp,PCR产物直接测序。结果在63株突变株中,在GyrA亚基发生的氨基酸替代有Ser83→Leu(62株)和Asp87→Asn(52株)、Asp87→Tyr(2株)、Asp87→His(2株);ParC亚基的氨基酸替代有Ser80→Ile(47株)、Ser80→Arg(2株)和Glu84→Val(3株)、Glu84→Lys(4株)、Glu84→Gly(5株)、Glu84→Ala(1株)。环丙沙星对菌株的MIC小于0.125μg.ml-1时,GyrA和ParC亚基均没有任何变异;环丙沙星的MIC为0.125～0.25μg.ml-1时,GyrA亚基出现单一氨基酸替代;环丙沙星的MIC为0.5～32μg.ml-1时,出现GyrA83位和87位双替代或者GyrA83和ParC80位双替代;环丙沙星的MIC为4～128μg.ml-1,发生GyrA双替代和ParC单替代;环丙沙星的MIC在16～128μg.ml-1,发生GyrA双替代和ParC双替代。结论不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌GyrA和ParC具有多种氨基酸替代类型,而且GyrA和ParC突变位点的数量与菌株对氟喹诺酮类耐药水平呈正相关。

山东地区禽源沙门菌的耐药基因流行性调查及分析

本研究旨在了解山东地区鸡场的禽源沙门菌在2008年和2012年的血清型、耐药基因流行性变化,为耐药沙门菌的流行提供防控依据。收集山东地区13个鸡场的94株沙门菌(2008年51株,2012年43株)进行血清型分析和PCR扩增,并对不同年份的PCR扩增结果用R软件进行相关性分析。结果显示,分离自山东地区养鸡场的沙门菌全部是印第安纳血清型;PCR结果显示,从2008年开始,携带blaCTX-M、aac(6′)-Ib-cr、oqx AB基因的沙门菌就已经在山东地区的鸡场内流行,4年后的2012年,这些多重耐药菌不但没有减少反而有增加的趋势,尤其是blaCTX-M-9G基因的检出率显著高于2008年。研究表明山东地区的禽源印第安纳沙门菌已成为该地区的优势流行菌群,并且同时携带能够介导人医和兽医临床耐药的多个耐药基因等方向发展,给临床有效治疗带来了巨大的挑战。

泰妙菌素混悬注射液在猪体内的药物动力学及生物利用度研究

【目的】研究并比较泰妙菌素混悬注射液和泰妙菌素注射液在猪体内的药物代谢动力学特征及生物利用度。【方法】7头健康猪,按随机拉丁方设计,进行单次给药剂量(10mg·kg-1b.w)静注、肌注泰妙菌素注射液和肌注泰妙菌素注射混悬液,高效液相色谱串联质谱法测定猪血浆中泰妙菌素的浓度,罗红霉素作为内标,3P97药动学计算软件处理血浆药物浓度-时间数据。【结果】猪静注给药的药时数据符合无吸收三室开放模型,主要药动学参数为:t1/2β为2.04±0.23h,t1/2α为0.39±0.06h,t1/2π为0.12±0.04h,Vd为8.73±1.83L·kg-1,AUC为3.78±0.52μg·mL-1.h-1,ClB为2.99±0.43L·kg-1.h-1)。猪肌注泰妙菌素注射液的药时数据符合一级吸收二室开放模型,主要的药物动力学参数分别为:t1/2Ka(0.06±0.01)h,t1/2β(3.67±0.41)h,Tmax(0.18±0.03)h,Cmax(1.32±0.25)μg·mL-1,AUC(2.62±0.21)μg·mL-1.h-1,生物利用度为73.51%。猪肌注泰妙菌素混悬液的药时数据则符合一级吸收一室开放模型,主要的药物动力学参数为:t1/2Ka(0.04±0.01)h,t1/2Ke(2.90±0.43)h,Tmax(0.27±0.03)h,Cmax(0.7±0.11)μg·mL-1,AUC(2.80±0.35)μg·mL-1.h-1,生物利用度为75.73%。t检验比较肌注泰妙菌素注射液和泰妙菌素注射混悬液的主要药动学参数,结果表明,两者除达峰浓度Cmax有显著差异外,AUC、t1/2Ka、Tmax、t1/2Ke和生物利用度均无显著性差异。【结论】泰妙菌素注射混悬液肌注后在猪体内具有吸收迅速,体内分布广,达峰迅速,消除较快的药动学特征。

广州市售肉类食品源大肠埃希菌耐药性分析

【目的】了解广州市售肉类食品源大肠埃希菌的污染和耐药情况。【方法】自2011年7月至8月,从广州市各大农贸市场和超市采集市售肉类样品310份,其中猪肉253份,鸡肉57份。采用选择性培养基分离鉴定大肠埃希菌Escherichia coli,琼脂稀释法测定大肠埃希菌对19种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。【结果】310份样品中共分离到213株大肠埃希菌,分离率为68.7%,其中猪肉源177株,鸡肉源36株。受试菌株对复方新诺明、链霉素和四环素的耐药率超过75.0%,对氨苄西林、萘啶酸、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、环丙沙星、安普霉素、恩诺沙星、庆大霉素和头孢唑啉的耐药率为10.0%~60.0%,而对头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶、黏菌素和阿米卡星表现较为敏感,耐药率小于5.0%。鸡肉源大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶和磷霉素的耐药率均高于猪肉源大肠埃希菌,差异极显著(P<0.01)。213株大肠埃希菌中82.2%为多重耐药菌。【结论】广州市售肉类食品存在较为严重的多重耐药大肠埃希菌污染,且鸡肉源大肠埃希菌耐药性较猪肉源大肠埃希菌严重。

动物性食品中大环内酯类药物残留检测技术研究进展

对目前动物性食品中大环内酯抗生素的残留检测方法进行了研究与探讨,指出有必要进一步完善与发展动物性食品中大环内酯抗生素残留的检测方法。

泰地罗新注射液在猪体内的药动学及生物利用度研究

【目的】以健康猪为研究对象,开展泰地罗新注射液在猪体内的药动学特征及生物利用度的研究,从而为泰地罗新的临床应用提供科学依据。【方法】选取20头健康猪,随机分为2组,按4 mg·kg^(-1)进行单次静注、肌注泰地罗新注射液,于注射后5 min、10 min、15 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d、13 d、14 d、15 d进行前腔静脉采血,采用Phenomenex Luna C18(150 mm×2 mm,5μm)。以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱程序洗脱,流速0.25 mL·min^(-1),柱温为30℃,进样量5.0μL。样品自然解冻,准确吸取0.5 mL血浆于5 mL离心管内,加入2 mL乙腈,涡旋混匀,震荡10 min,8 000 r/min离心10 min,取上清液35℃下氮气吹干,1 mL复溶液复溶,过0.22μm微孔滤膜,LC-MS/MS检测分析。泰地罗新在4—1 000 ng·mL^(-1)的浓度范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.994—0.998,检测限为2 ng·mL^(-1),定量限为4 ng·mL^(-1),该方法的相对回收率为87.91%—104.93%,呈良好的线性关系,相关系数为0.994—0.998。批内变异系数为2.12%—12.09%,批间变异系数3.92%—10.65%。该方法灵敏度高,操作简便,可以用于泰地罗新在猪体内的药代动力学研究。泰地罗新采用电喷雾离子源(ESI)离子化;正离子模式扫描;多反应监测模式(MRM),电喷雾电压(IS)为5500V;雾化气压力(GS1)为50psi;辅助气流速(GS2)为50 L·min^(-1),气帘气压力(CUR)为25 psi;离子源温度(TEM)为550℃;碰撞室压力(CAD)为6 psi。m/z→734.6/98.1和m/z→734.6/174.4。HPLC-MS/MS法检测猪血浆中泰地罗新的浓度。采用药动学软件Winnonlin5.2.1的非房室模型分析方法,计算有关药物动力学参数。【结果】猪静脉注射给药后,AUC_(last)和AUC_(inf(pred))分别为(18030.30±7560.75)h·ng·mL^(-1)和(18795.31±7455.23)h·ng·mL^(-1)。t_(1/2)为(99.42±22.25)h,MRT为(81.71±12.15)h。肌肉注射给药后,C_(max)为(886.00±155.63)ng·mL^(-1),T_(max)为(0.51±0.30)h,AUC_(last)和AUC_(inf(pred))分别为(19702.05±6442.36)h·ng·mL^(-1)和(20840.08±6849.76)h·ng·mL^(-1)。t_(1/2)为(100.83±20.23)h,MRT为(81.80±9.44)h。绝对生物利用度为109.27%。【结论】泰地罗新肌注后在猪体内具有吸收迅速,分布广泛,达峰迅速,消除较慢,生物利用度高等特点,可在兽医临床上安全使用。

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg^(-1)体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆氟苯尼考的浓度,采用紫外检测器检测,检测波长为223 nm,流动相为乙腈和水,其体积比为26和74,流速为1 m L·min-1,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm),进样量为20μL。药动学分析软件Win Nonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据,计算相关的药动学参数,并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81)L·kg^(-1),体清除率(ClB/F)为(0.64±0.11)L·h-1·kg^(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.57±0.51)h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87)μg·m L-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(Cmax)为(19.77±1.82)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46)L·kg^(-1),体清除率(ClB/F)为(0.63±0.08)L·h-1·kg^(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.74±0.54)h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62)μg·m L-1·h。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数,结果表明,除了Cmax差异显著(P<0.05),其他参数差异均不显著(P>0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较,感染鸭体内的Cmax显著低于(P<0.05)健康鸭体内的C_(max),其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg^(-1)体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速,峰浓度高,体内分布广泛,消除较快的特点。

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。

甘草主要成分抗H9N2亚型流感病毒作用研究

利用H9N2亚型流感病毒鼠肺适应株感染小鼠,以肺指数抑制率、肺组织病毒滴度、死亡保护率和生命延长率为评价指标,研究了甘草酸单铵盐、甘草次酸、甘草黄酮等甘草中3种主要成分和甘草粗提物对感染H9N2亚型流感病毒小鼠的防治效果。结果表明,甘草粗提物及甘草酸单铵盐口服均能显著抑制H9N2亚型流感病毒鼠肺适应株引起的小鼠肺炎实变(P<0.01),甘草粗提物20 mg/kg组能明显延长流感病毒感染小鼠的生存时间。

低剂量恩诺沙星对SPF小鼠肠道菌群的影响研究

采用SPF小鼠动物模型研究了低剂量恩诺沙星对肠道菌群细菌数量、细菌耐药性和定植抗力的影响。连续饮水给药(1、10和100mg·L-1)48d后,恩诺沙星对SPF小鼠肠道菌群的主要影响为:10和100mg·L-1恩诺沙星可抑制部分需氧和兼性厌氧菌的生长(P<0.05或P<0.01);100mg·L-1恩诺沙星可抑制肠球菌和部分拟杆菌的生长(P<0.05或P<0.01);1、10和100mg·L-1恩诺沙星使需氧和兼性厌氧菌对环丙沙星的耐药率增加(P<0.05或P<0.01);100mg·L-1恩诺沙星使拟杆菌对环丙沙星的耐药率增加;1、10和100mg·L-1恩诺沙星可降低部分SPF小鼠肠道菌群的定植抗力,使菌群对外源细菌的屏障作用下降。低剂量恩诺沙星对肠道菌群数量和定植抗力影响不大;恩诺沙星对肠道菌群的主要影响是使需氧和兼性厌氧菌的耐药率增加;中国现行规定的恩诺沙星和环丙沙星的日允许摄入量(ADI)可能也会对人体肠道菌群产生影响,主要为选择出耐药需氧和兼性厌氧菌。

气相色谱-质谱法检测猪肌肉中8种性激素的残留

【目的】建立己烯雌酚、甲睾酮、炔诺酮、17α-乙炔雌二醇、雌二醇、6α-甲基-17α-羟基孕酮、苯甲酸雌二醇和乙酸氯地孕酮8种性激素在猪肌肉中残留的气相色谱-质谱(GC-MS)检测和确证方法。【方法】猪肌肉样品经过初提,去脂肪,固相萃取小柱净化,衍生化,最后用GC-MS检测和确证。【结果】此法在浓度2.5～50μg·kg-1保持良好的线性,相关系数大于0.97,在2.5、10、50μg·kg-1的添加水平上,8种性激素各组分的回收率(%)、批内变异系数(%)、批间变异系数(%)的范围分别为:己烯雌酚78.5～148、6.3～12和8.9～10,甲睾酮70.8～109、4.1～11和6.6～7.5,炔诺酮69.8～87.2、4.0～10和6.7～8.8,17α-乙炔雌二醇67.7～120、4.2～12和9.3～10,雌二醇82.8～103、0.4～10和6.8～11,6α-甲基-17α-羟基孕酮70.3～99.2、2.7～9.3和5.9～7.8,苯甲酸雌二醇73.0～104、5.4～12和9.7～12,乙酸氯地孕酮72.9～91.8、3.3～9.2和8.0～8.6。检测限和定量限(μg·kg-1)分别为:己烯雌酚0.99和3.30;甲睾酮1.05和3.50;炔诺酮1.19和3.97;17α-乙炔雌二醇0.94和3.13;雌二醇1.45和4.83;6α-甲基-17α-羟基孕酮1.56和5.20;苯甲酸雌二醇1.92和6.40;乙酸氯地孕酮2.41和8.03。【结论】所建立的检测方法具有简便、准确、灵敏、适用性强及有机溶剂污染小等特点。

临床分离鸡毒支原体粘附素蛋白编码基因pvpA的分子特征

【目的】探讨中国临床分离鸡毒支原体粘附素蛋白(PvpA)编码基因pvpA的分子特征,为进一步了解鸡毒支原体致病机制、建立新的鉴别诊断方法奠定基础。【方法】利用巢式PCR法对41株广东、四川和北京地区临床分离的鸡毒支原体和3株参考株的pvpA基因进行扩增并测序,分析中国临床分离株pvpA的基因变异特征。【结果】所有临床分离株pvpA基因分子特征与强毒株S6,BG44T一致,与疫苗株F36完全不同。临床分离株pvpA基因C-末端DR-1、DR-2区域(第670位～第1056位)GC的含量为53.52%,明显高于鸡毒支原体的平均GC含量;所有临床分离株及S6、BG44T在DR-1和DR-2之间丢失60个碱基。推测该区域编码的氨基酸序列富含脯氨酸,高达30.27%;重复四肽Pro-Arg-Pro-X共出现10次,X为甲硫氨酸6次、甘氨酸1次、天冬酰胺1次、谷氨酰胺2次。而疫苗株F36PvpA只有DR-1区域,与R株相比间隔25肽缺失了24个肽,DR-2区域全部丢失。【结论】临床分离株pvpA基因变异特征与强毒株S6一致,与疫苗株F36的变异特征有显著差异,可以把pvpA基因作为靶标以建立临床鸡毒支原体流行病调查和诊断的新方法。

猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

【目的】猪表皮生长因子(pEGF)具有刺激静止期猪卵母细胞的成熟以及刺激仔猪胃肠上皮细胞成熟的功能,从而可以提高母猪繁殖率和降低断奶仔猪的应激。因此开发猪表皮生长因子具有重要意义。【方法】用人工合成的pEGF基因为模板,用PCR扩增获得pEGF-6His片段,将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9-pEGF并电转化毕赤酵母。用斑点杂交法筛选多拷贝整合转化子即基因工程菌,用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,纯化产物用抗His-tag的单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹、氨基端测序鉴定、体外生物活性检测。【结果】斑点杂交法筛选中信号越强的转化子,甲醇诱导表达的目的蛋白含量越高。免疫印迹中可以观察到印迹条带。氨基端氨基酸测序发现纯化的表达产物含有2条肽链,其N-端15个氨基酸的序列分别与天然的pEGF以及Glu-Ala-pEGF的序列相同。体外生物活性检测结果表明,纯化的表达产物对BALB/c3T3细胞具有显著的增殖作用。【结论】本研究获得了能高效表达具有生物学活性的重组猪表皮生长因子的基因工程菌。