当前禽病多发原因、重要病毒性疾病流行特点与防控对策

近期，全国家禽业的生产形势稳定，总体效益趋好。从疫病监测情况看，虽然没有发生高致病性禽流感等重大动物疫情。但疾病的种类与往年相比并未减少，其中绝大部分仍然是病毒性传染病。另外，疫病发生的频次偏高，有些病还呈现出地方性流行的特点。再者，病原体变异和混合感染的现象较为普遍，导致疾病的临床表现非典型化。

一株广东鸽新城疫病毒的生物学特性分析

为了解广东地区鸽新城疫病毒的生物学特性,对广东分离株SD54进行了鸡胚平均死亡时间(MDT)、6周龄鸡静脉接种的致病指数(IVPI)、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)的测定,并对该毒株F基因的重要功能区片段进行RT-PCR扩增、测序,利用MEGA 4软件绘制系统进化树。经测定,分离株SD54的MDT为60 hI、VPI为2.49I、CPI为1.6;其F基因裂解位点的氨基酸序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒株F基因裂解位点氨基酸序列的特征;系统进化树表明该毒株属于基因Ⅶ,与广西鸽源株Gxp40处于同一细分支,同源性最近,表明该分离株SD54为基因Ⅶ强毒株。

一株鸽源新城疫病毒的分离鉴定

从广东发病鸽群中采集的拭子样本中分离到1株新城疫病毒,用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)及基因测序等对其进行鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且可与新城疫病毒标准阳性血清发生特异性抑制反应;用针对新城疫病毒的F基因及P基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,可扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明,其与美国新城疫病毒分离株Pigeon/US(TX)/98的F基因核苷酸序列相似性高达97%以上。毒株被鉴定为鸽源新城疫病毒,并命名为Pigeon/Guangdong/ZQ-17。

华南地区两株副猪嗜血杆菌的生物学特性与致病性研究

本试验旨在对来源于广东省的两株副猪嗜血杆菌的生化特性、血清型、耐药性、生长特性以及毒力和免疫原性进行研究。试验结果表明,两株菌分别为血清4型和5型;两株菌均具有较好的生长能力,培养10 h活菌含量都能达到109以上;其LD50分别是1.52×109CFU和9.3×108CFU;分离菌株对喹诺酮类和磺胺类抗生素有较强的抵抗力;免疫试验结果表明,两株菌具有较好的免疫原性。以上试验结果表明,这两株菌可以作为疫苗的基础候选菌株。

1株鸭源新城疫病毒的分离鉴定及生物学特性研究

从广东地区发病鸭中分离到1株新城疫病毒,血凝试验、血凝抑制试验结果表明此分离株具有血凝活性,且这种血凝性可被NDV标准阳性血清抑制,而不能被AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、EDSV阳性血清抑制;用针对NDVF基因特异性鉴定引物对该分离株进行聚合酶链反应扩增,可扩增出相应的目的片段。由此,初步鉴定该分离株为鸭源新城疫病毒,并命名为NDV/DUCK/SD/2006。另外,通过毒力测定,该毒株的MDT、IVPI分别为51.75 h、2.44,判定为强毒力株。

众生丸在小鼠体内抗H5N1亚型禽流感病毒的实验研究

目的:研究众生丸在小鼠体内对禽流感病毒H5N1亚型的抑制作用。方法:以达菲为阳性对照,观察众生丸对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用和对染毒小鼠的死亡保护作用,从而判定其抗流感病毒作用。结果:与病毒对照组相比较,众生丸可降低禽流感病毒性肺炎小鼠肺指数,调节T淋巴细胞亚群,降低小鼠血清中TNF-α含量,促进IFN-γ和IL-10产生,减轻肺间质、肺泡内炎症;众生丸低剂量组对H5N1亚型禽流感病毒所致小鼠的死亡有降低作用,并延长生存时间。结论:众生丸对H5N1禽流感病毒感染小鼠所致肺病变具有抑制作用。

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定

为了对广东地区某鸽场疑似鸽新城疫病毒感染的鸽群进行病原学诊断,试验采用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、F基因扩增及序列测定等一系列综合试验对其进行病原学鉴定。结果表明:该分离株具有血凝活性,且这种血凝性可被新城疫病毒(NDV)标准阳性血清抑制,而不能被减蛋综合征病毒(EDSV)、禽流感病毒(AIV)-H5、AIV-H7、AIV-H9阳性血清抑制;用针对NDV F基因设计的特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,可扩增出相应的目的片段;该分离株与天津分离株AG/Tianjin/07的核苷酸序列的相似性高达99%。说明该分离株为鸽新城疫病毒,命名为Pigeon/Guangdong/SD54/2006。

鹅源新城疫病毒HN基因“自杀性”DNA疫苗的构建及其免疫效果的研究

为了探讨鹅源新城疫病毒"自杀性"DNA疫苗的免疫效果,将鹅源新城疫病毒HN基因片段克隆到自杀性DNA疫苗载体pSCA1中,构建了表达HN基因的自杀性DNA疫苗质粒pS-HN。间接免疫荧光试验结果证实,该质粒转染BHK-21细胞后实现了HN基因在该细胞中的表达。将该疫苗和常规DNA疫苗(pc-HN)分别免疫鹅,结果表明,在诱导体液、细胞免疫和攻毒保护方面,pS-HN均优于pc-HN,这为进一步评价该疫苗的免疫保护效果奠定了基础。

2009～2010年华南地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱的鉴定和分析

本试验采用肠杆菌基因间重复一致序列多态性聚合酶链式反应（ERIC-PCR）对2009~2010年分离自华南地区的41株副猪嗜血杆菌野生菌株及15株参考菌株进行了指纹图谱的鉴定。利用BioNumerics 5.1软件对所有菌株的ERIC-PCR指纹图谱进行分析,结果显示,15株具有不同血清型的参考菌株均具有不同的指纹图谱;41株华南地区副猪嗜血杆菌野生分离株则具有26个不同的指纹图谱,该方法对所有56株副猪嗜血杆菌的鉴别率为0.984。由此可见,ERIC-PCR分型方法具有较好种间的鉴别能力,可作为副猪嗜血杆菌病流行病学研究中的一种有效的辅助分子手段。

鸡IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上鸡α-、β-、γ-干扰素（ChIFNα-、β-、γ-）基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以鸡3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因为内参，采用SYBRGreen工染料以建立实时荧光定量PCR检测方法。将IFNα-、β-、γ-基因克隆至pGEM-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，鸡IFNα-、β-、γ-和GAPDH基因的C1值与标准品稀释度在1×10^2～1×10^8 copies／μL范围分别呈良好的线性关系，r^2均大于0．990。熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4h。建立的鸡IFNα-、β-、γ-基N实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在mRNA水平对鸡IFN的定量分析奠定了基础。

J亚群禽白血病病毒SCAU-0901株的分离鉴定

在组织病理学观察的基础上,经接种DF-1细胞系、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),从送检的疑似禽白血病感染的麻黄肉种鸡中分离并鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为SCAU-0901。利用特异性引物分别扩增出长度为545 bp和2.2×103bp的目的片段,并对目的片段进行了克隆测序。序列分析发现,SCAU-0901株的gp85基因与国内外各ALV-J毒株相应核苷酸序列的相似性为86.1%～95.1%,其中与BJ0303株的相似性最高(95.1%),与ADOL-7501株的相似性最低(86.1%)。系统遗传进化分析表明,SCAU-0901株的gp85基因片段与BJ0303株的亲缘关系最近。

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)血凝素基因序列,设计了1套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。结果表明,该方法对H5-AIV RNA的最小检测限为10-6,灵敏性高于一步RT-PCR方法;全部反应可在1.5 h内完成;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明,该方法灵敏度高、特异性好,能够作为H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法。

血管瘤相关J亚群禽白血病病毒ZH-08株的分离与全基因组序列测定

本研究从临床表现为典型血管瘤型禽白血病病例的广东某肉种鸡场的病鸡中,分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为ZH-08。利用ELISA抗原检测、PCR和间接免疫荧光试验对分离株进行鉴定,结果都呈阳性。依据ALV-J原型株HPRS-103前病毒全基因组序列设计并合成3对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示该分离株基因组序列全长7 597 bp,与已公开的全基因组序列大小比较略有差异,但符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp85基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较,发现ZH-08与YZ9901株相似性最高(93.7%)。基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明:ZH-08株与SD07LK1株的亲缘关系最近。本研究为该毒株的生物学特性以及致病机制研究奠定了基础。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

对广东15个送检的疑似猪传染性副猪嗜血杆菌病的病猪样品,用TSA培养基进行细菌的分离,并对分离菌株进行细菌的形态观察、培养特性和生化试验鉴定,以及用副猪嗜血杆菌16S rRNA基因的特异性引物进行PCR鉴定。试验结果表明,有7株分离菌株扩增出了821 bp的特异性目的条带,结合形态观察、培养特性和生化试验鉴定,结果表明成功分离到了7株副猪嗜血杆菌;药敏试验结果显示,分离菌株对氨苄西林、多粘菌素、庆大霉素等药物较敏感。

副猪嗜血杆菌主要毒力因子和致病机理的研究进展

副猪嗜血杆菌病又称革拉斯氏病(Glasser’s disease),引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎,是近年来严重危害养猪业的细菌性传染病,呈世界性分布,并已证实在中国绝大多数猪场存在和流行。副猪嗜血杆菌的血清型众多,不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大,对其毒力因子了解很少,对其主要的致病机理更是知之甚少,现已发现该病原可能的毒力相关因子有荚膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白及酶类等。笔者对这些毒力因子及该病的致病机理进行综述,以期为该病的防控提供科学依据。

广东省部分规模化猪场乙脑抗体的监测与分析

采用ELISA的方法,于2008年7月到2009年6月期间,对广东省16个规模化猪场进行了为期1年的乙脑血清抗体的系统监测。结果显示,免疫过的种猪的血清阳性率为92.4%,而未免疫的商品猪也达到了54.5%。表明在广东省的规模化猪场中普遍存在乙脑流行,加强乙型脑炎的防控工作,避免人猪间乙脑的相互传播具有重要意义。

血管瘤相关禽白血病病毒CD08株的分离与鉴定

通过病理剖检、接种DF-1细胞、ELISA抗原检测以及聚合酶链式反应（PCR）等方法,从湖南常德某集约化养殖场的疑似禽白血病感染的蛋鸡中分离到1株血管瘤相关B亚群禽白血病病毒（ALV-B）,命名为CD08。利用特异引物对分离株进行PCR检测和gp85扩增,将测序得到的gp85序列与国内外各亚群禽白血病病毒相同区域序列进行相似性分析,发现其核苷酸序列相似性在44.3%-92.9%之间,其中与属于ALV-B的MAV-2株相似性最高,而与美国ALV-J ADOL-7501株相似性最低。基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明：CD08株的gp85序列与MAV-2株的亲缘关系最近。

J亚型禽白血病病毒感染黄鸡病毒血症和抗体反应动态的研究

将血管瘤病变型相关的J亚型禽白血病病毒(ALV-J)SCAU-HN06株通过尿囊腔途径接种黄鸡11日龄鸡胚,对其出壳后不同时间点(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20周)的病毒血症、ALV-J特异性抗体及泄殖腔拭子p27抗原分别进行了动态检测。试验结果表明,SCAU-HN06组在1周即检测到病毒血症,7周时有一个高峰,9周后病毒血症阳性率始终维持在80%以上;从6周时开始检测到ALV-J特异性抗体,但监测过程中抗体阳性率最高仅为33.3%(18周),其余均在22%以下;泄殖腔p27抗原阳性率在前3周迅速升高,3周时达到顶峰,随后维持较高的阳性率。由研究结果可知,经鸡胚接种ALV-J的感染黄鸡可导致持续性病毒血症,并容易产生免疫耐受;这项研究可为黄鸡ALV-J的防控与净化提供科学依据。

猪链球菌2型毒力相关因子的研究进展

目前,猪链球菌(Streptococcus suis)病已成为严重影响各国养猪业发展和人类健康的一种重要的人兽共患传染病。猪链球菌的血清型众多,有35个血清型,其中猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2,SS2)的致病性强、流行范围广,而且它的毒力因子在该菌的致病过程中发挥着重要的作用。但是猪链球菌2型毒力因子认识的缺乏是制约该病有效防制的关键,因此作者对SS2已发现的毒力因子和新发现的一些毒力相关因子进行了广泛深入的论述,为该病的预防、治疗提供科学依据和参考。

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×105。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。