影响非洲猪瘟病毒对培养细胞感染性的因素分析

猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)是非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要靶细胞,除宿主单核/巨噬细胞外,ASFV难以在其他体外细胞系中持续生长繁殖。本研究旨在研究影响ASFV在体外感染能力的因素。通过比较ASFV接种易感细胞PAMs和非易感细胞系3D4/21、PK15细胞的全基因组转录谱差异;使用小分子药物改变细胞代谢或周期、物理方法改变细胞黏附;通过荧光定量PCR、Western blot、红细胞吸附检测病毒在3D4/21和PK15细胞系中的增殖情况。结果表明:ASFV接种3D4/21和PK15两种细胞与PAMs细胞的共同差异基因显著富集在细胞黏附、细胞周期和细胞代谢等方面;使用多种调控细胞周期、细胞代谢的小分子药物处理细胞后对ASFV感染PK15和3D4/21细胞的能力无显著影响;通过悬浮培养来调节细胞的黏附后,显著提高ASFV感染PK15和3D4/21细胞的能力,但随着传代次数的增加,病毒的复制能力逐渐下降。综上所述,细胞黏附可能是影响ASFV体外感染能力的重要因素之一,但是改变细胞黏附后并不能维持ASFV的复制能力。本研究为ASFV体外细胞系的建立提供了初步参考。

非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体,根据HLJ/2018株的I177L序列,设计引物,扩增带有His标签序列的I177L序列,并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达和切胶纯化后,用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下,诱导5 h后,重组MBP-I177L蛋白表达量最高,蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符;重组蛋白以可溶性表达为主;多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示,抗体效价为1∶128000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。

基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R^(2)均在0.99以上,扩增效率E为88%~90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×10^(2)拷贝/μL和4.09×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%,重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。