广东省某屠宰场猪源肠球菌的分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

【目的】了解猪源性肠球菌分离株的耐药情况及毒力因子携带情况,为肠球菌的耐药监测提供数据支持并为制定合理的治疗方案提供科学依据。【方法】本研究对广州市某大型屠宰场屠宰环节156份猪小肠样品进行肠球菌的分离培养、革兰染色、PCR鉴定,采用琼脂扩散法对菌株进行14种抗菌药物和2种消毒剂的最小抑菌浓度(MIC)测定,利用PCR技术检测耐药基因、毒力基因和消毒剂抗性基因的携带情况。【结果】本研究分离到84株肠球菌(分离率为53.85%),包括44株粪肠球菌和40株屎肠球菌;分离培养可见菌落边缘光滑整齐、圆形或卵圆形排列、菌落周围培养基呈现黑色的菌落;疑似菌落革兰染色后呈圆形的革兰阳性球菌,单个或成堆排列在一起。对疑似菌落DNA进行PCR扩增,其中粪肠球菌引物扩增出大小约941 bp的条带,16S rRNA引物扩增出大小约1500 bp的条带。药敏试验结果显示,44株粪肠球菌对克林霉素、多西环素、头孢噻呋、庆大霉素、红霉素、苯扎氯铵和氟苯尼考的耐药率较高,分别为97.7%、90.9%、88.6%、88.6%、81.8%、81.8%和77.3%;40株屎肠球菌对克林霉素、头孢噻呋、多西环素、庆大霉素、氟苯尼考和红霉素的耐药率分别为90.0%、90.0%、85.0%、77.5%、72.5%和67.5%。毒力基因与消毒剂抗性基因检测结果显示,粪肠球菌efa、gelE、fsrC毒力基因的检出率较高,分别为95.5%、84.1%和84.1%;emeA、gsp 65消毒剂抗性基因的检出率较高,分别为95.5%和90.9%。屎肠球菌仅检测到fsrB毒力基因,检出率为2.5%,无消毒剂抗性基因的检出。【结论】本研究分离的猪源肠球菌对大部分抗菌药物具有较高的耐药率,部分菌株还对利奈唑胺产生耐药,亟需加强对猪源肠球菌的流行病学监测。

广东省腹泻仔猪大肠杆菌blaCTX-M-65与mcr-1基因共传播特征

【目的】调查分析广东省某生猪养殖场腹泻仔猪的大肠杆菌耐药情况以及同时携带blaCTX-M-65与mcr-1两种耐药基因的阳性大肠杆菌的分子特征与其共同传播特征,为耐药性监测及风险防控提供科学依据。【方法】从广东省肇庆市某生猪养殖场采集腹泻仔猪直肠棉拭子样品90份,并进行大肠杆菌分离鉴定;采用PCR方法检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与mcr-1基因,通过测序确定CTX-M亚型;采用琼脂二倍稀释法和微量肉汤稀释法测定分离菌对12种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC);使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)及多位点序列分型(MLST)分析菌株间的遗传背景;通过接合转移方法确定质粒水平转移的能力;使用复制子分型、S1-PFGE、Southern blotting方法检测质粒类型、耐药基因的定位及定位质粒的大小;通过三代测序及序列分析确定质粒的重组过程。【结果】共分离鉴定86株大肠杆菌,检测到44株携带CTX-M型ESBLs基因,其中blaCTX-M-55基因最流行(n=16,36.4%),其次是blaCTX-M-65(n=10,22.7%)、blaCTX-M-27(n=8,18.2%)、blaCTX-M-15(n=5,11.4%),还检测出blaCTX-M-79(n=2,4.5%)、blaCTX-M-14(n=2,4.5%)和blaCTX-M-24(n=1,2.3%)。10株blaCTX-M-65基因阳性菌有8株同时携带mcr-1基因。这8株大肠杆菌均表现为多药耐药,包括氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、头孢喹肟、黏菌素等多种抗生素。8株菌共分为6种ST型、7个PFGE谱型。接合转移试验发现,有6株菌的blaCTX-M-65和mcr-1基因发生了共转移,且blaCTX-M-65与mcr-1基因均位于IncHI2型(253 kb)质粒上。其中1株菌在接合转移的过程中,其所携带的一个253 kb IncHI2质粒与一个69 kb IncFⅡ质粒发生融合,形成一个大小323 kb的融合质粒。对融合质粒进行三代测序解析,结果表明,在接合转移的过程中IS26介导了两个不同大小质粒的重组。【结论】IncHI2质粒是介导blaCTX-M-65和mcr-1基因共同传播的主要媒介,IS26通过与靶位点GTTTCACT的整合导致IncHI2质粒与IncFⅡ质粒融合。质粒重组扩大了大肠杆菌的耐药谱,加速了耐药基因的传播,促使多药耐药现象更严重,对公共卫生安全构成威胁,本研究为阐明多重耐药大肠杆菌的传播机制提供了参考依据。

寡核苷酸芯片检测兽医病原菌耐药性的研究

利用寡核苷酸芯片(oligonucleotide array)对兽医临床常见病原菌耐药性检测进行了初步研究。设计1对兼并引物扩增3种病原菌(E. coli、S. aureus、M. gallisepticum)的gyrA基因片段,并用cy5-dCTP标记荧光。设计一系列检测病原菌对氟喹诺酮类药物耐药的寡核苷酸探针,将探针固定在APS-PDC法制作的Microarray上,用标记的PCR产物与之杂交,置于Scanarrray4000中扫描,利用ImaGene3.0软件对杂交图像进行分析。研究结果表明,设计的兼并引物能很好地扩增出3种病原菌的gyrA基因片段,与Microarray杂交后在相应的位点出现可检测的杂交信号,样本O78S(禽大肠杆菌)、SS(金黄色葡萄球菌)、S6-10(鸡毒支原体)的ratio比值均≥2,说明这3株是敏感株;样本EDr(犬大肠杆菌)、ECr(猫大肠杆菌)与a1探针(检测GyrA第83位氨基酸发生突变的探针)的ratio比值≤0.5,说明这两株是耐药突变株,均与样本的实际情况相吻合。说明利用Oligonucleotide array能快速准确地检测出GyrA亚基第83、87位发生突变的耐药菌株,是可行、有效、快捷的抗菌药耐药性的监测方法。本研究为进一步研制和开发兽医临床常见病原菌耐药性检测芯片打下初步基础。

生理药动学模型及其在兽医药理学研究中的应用

生理药动学模型是一种模拟机体循环系统的血液流向,将各器官或组织相互联结起来而建立的整体模型,和经典房室模型与统计矩原理相比,生理模型有其独特的优越性。建立药动学生理模型的主要步骤包括收集资料、设计血流图、建立物质平衡方程组、验证和修订模型。目前,国内外学者已开展了数十种化合物在动物或人体内的生理药动学模型研究。生理模型在开展兽医药动-药效模型研究、指导兽药临床合理应用、指导新兽药的研发、评估兽药残留风险等方面具有良好的应用前景。

穿心莲兽医药理学研究进展

文章综述了近年来国内对穿心莲的化学成分,色谱指纹图谱,对动物体生理功能的影响,药代动力学以及毒副作用的兽医药理学研究新进展。

广东地区2007～2009年禽源大肠杆菌的耐药性演变

通过对2007～2009年内从广东省10多个地市分离得到的378株禽源大肠杆菌进行15种兽医临床常用抗生素的药物敏感性试验(MIC),调查该区域禽类大肠杆菌的耐药性演变情况。采用琼脂稀释法对临床分离株开展MIC测试。结果显示临床分离株对多数兽医临床常用抗生素耐药率在30%以上,且有逐年上升的趋势,多数药物的半数抑菌浓度(MIC50)和有效抑菌浓度(MIC90)水平高且保持逐年升高的趋势;细菌的多重耐药情况严重,多集中在5～12耐,提示细菌的耐药能力逐渐提高。表明,广东地区禽源大肠杆菌的耐药水平已经达到了较为严重的程度,应加强食用动物源细菌耐药性的监测。

兽药对生态环境影响的研究进展

综述了兽药对陆生和水生生态环境影响方面的研究进展,探讨了兽药对陆生植物、土壤动物、土壤微生物与原生生物等陆生生态环境的影响及对浮游类生物与微生物、鱼虾与水体甲壳动物等水生生态环境的影响及其生态毒理效应。

抗微生物药物PK-PD研究在优化兽药给药方案中的应用

PKPD模型可用于优化兽药给药方案,制订合理的给药间隔和剂量,在减少细菌耐药性方面有重要意义。本文综述了β内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类等抗微生物药物的PKPD研究现状,以期为兽药厂家在药物开发、设计合理的剂型与给药方案方面提供依据。

兽用化学药物研发动向

分析了国外兽用化学药物的研发趋势和特点,主要是食品动物用药减少,宠物用药明显增加,重点研发抗寄生虫药;认为应重视开发复方制剂和系列制剂,大力开发非甾体抗炎药。介绍了我国兽药的研发趋势和特点:食品动物用药、抗微生物药占主导地位,兽药剂型和制剂种类单一,中兽药品种繁多,认为我国兽药研发应当以仿制为主、创新为辅,积极研发新剂型和新制剂,加强水产养殖动物用药及宠物用药的开发,加强复方药物、饲料药物添加剂、中兽药和生物工程药物的研发。

穿心莲内酯干混悬剂对人工感染大肠杆菌致肉鸡腹泻的药效评价

本试验旨在评价穿心莲内酯干混悬剂对大肠杆菌感染致肉鸡腹泻的治疗效果,为其临床应用提供试验依据。选取12日龄健康试验鸡300只,随机分为5个组,每组4个重复,每个重复15只。包括空白对照组、大肠杆菌ETECO101攻毒组、大肠杆菌攻毒加100和200 mg·L^(-1)穿心莲内酯干混悬剂及60 mg·L^(-1)粘菌素组。肉鸡15日龄通过腹腔注射0.2 mL含5×108 cfu·mL^(-1) ETECO101的生理盐水感染细菌,空白对照组腹腔注射0.2 mL生理盐水。细菌感染前3 d开始通过饮水给药,早、晚各给药1次,每次每个重复700 mL,连续给药至攻菌后第3天停止给药。每组随机选取1个重复,于攻菌后24 h和第5天分别选取6只鸡采血、剖检和取组织样,用于肝组织病理学观察、小肠微结构分析、免疫器官指数测定和血液生化指标分析。每组剩余3个重复(45只)试验至攻菌后第7天,计算存活率、粪便评分、平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI),以评价药物的药效。结果显示,相对于ETECO101组,药物含量为100和200 mg·L^(-1)的穿心莲内酯干混悬剂组肉鸡存活率分别提高13.3和17.8个百分点(P<0.05),减轻大肠杆菌感染导致的腹泻,显著提高肉鸡ADG(P<0.01)和ADFI(P<0.01);200 mg·L^(-1)穿心莲内酯干混悬剂组显著地增加了攻菌后24 h肉鸡脾脏和法氏囊指数(P<0.01),降低了攻菌后第5天肉鸡血清中球蛋白(GLB)和白蛋白(ALB)含量(P<0.05),有效地抑制肉鸡血清中丙二醛(MDA)含量的增加,提高肉鸡血清超氧化物歧化酶(SOD)活力(P<0.01)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力(P<0.01)。同时,200 mg·L^(-1)穿心莲内酯干混悬剂组可显著改善肉鸡空肠绒毛高度(P<0.05),以及绒毛高度与隐窝深度的比值。综上所述,饮水中添加穿心莲内酯干混悬剂可减少大肠杆菌感染导致的鸡死亡,改善肉鸡生长性能、血清氧化应激状态和空肠肠道形态,提高法氏囊指数,对大肠杆菌感染而导致的肉鸡腹泻具有显著疗效。

应对细菌耐药策略研究进展

细菌耐药性与畜牧产业发展、人类公共卫生安全和食品安全密切相关。细菌产生耐药的机制复杂,除由人-动物-环境三者之间复杂作用引起外,抗生素的使用对细菌耐药性的产生和传播具有非常重要的影响,需要采取多种策略应对细菌耐药性的产生。新发展的药物理论及分子生物学等技术的兴起,极大地推动了对细菌耐药机制的认识、新型抗菌药物的发现及药物的合理使用,为控制细菌耐药性的产生提供了重要的理论依据和技术手段。当前,细菌耐药性已然是不可忽视的严重问题,引起了多方关注。细菌耐药机制的复杂性及新药研发的困难性,决定了必须通过多种方法、多种途径和多种角度开展研究,从而控制其进一步发展。基于目前的研究现状,笔者归纳总结了多种应对细菌耐药的策略及方法,重点从新型抗菌药的研发、联合用药、药代动力学-药效动力学同步模型及多组学技术等方面阐述其在应对细菌耐药性方面的作用,以期为减缓和控制细菌耐药性的产生及临床治疗细菌感染提供参考和指导。

不同地区猪源和禽源大肠杆菌耐药性监测

2003--2005年自我国6省1市分离鉴定出133株猪源和455株禽源大肠杆菌临床株．采用微量肉汤稀释法测定了对20种抗菌药物的敏感性．结果表明，无论猪源还是禽源大肠杆菌对12种喹诺酮类药物耐药率非常高（耐药率范围34．96％-96．71％），对8种非喹诺酮类药物（除阿米卡星呈较低的耐药率外）也呈较高的耐药率（22．42％-94．07％）；多重耐药现象十分严重，3耐及3耐以上菌株占总菌株94％以上；不同地区来源菌株的耐药模式总体一致，但存在耐药水平高低的差异．

宠物源大肠杆菌的血清型和毒力基因及耐药性调查

为研究宠物源致病性大肠杆菌(Escherichia coli)的血清型、毒力基因和耐药性之间的相关性,本研究由健康和患病犬、猫直肠拭子样品中分离177株E.coli,并采用玻片凝集法鉴定其血清型,结果显示分离株中定型菌株135株,分别属于20个不同的血清型,其中O1、O2和O8为主要的流行血清型。PCR方法检测11种毒力相关基因,并采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药的敏感性,结果表明3个血清型的菌株拥有相似的耐药表型,但毒力基因谱不同。62%的分离菌株携带fimH基因,并且毒力基因组合iroN+hlyF、iroN+fimH和traT+sitA比较流行。55%的O1血清型携带fimH基因,并且多数耐受四环素、多西环素、头孢噻吩和庆大霉素;20.8%的O2血清型菌株携带traT和sitA基因;50%的O8血清型携带traT和fimH基因。3个血清型分离菌株多数对安普霉素和阿米卡星敏感。

二氟沙星在鸡体内的药物代谢动力学及生物利用度研究

将 30只艾维茵肉鸡随机分为 3组 ,进行了静脉注射、肌肉注射及内服二氟沙星的药物代谢动力学研究。血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白 ,高速离心 ,用反相高效液相色谱法测定鸡血浆中二氟沙星的浓度 ,MCPKP计算机程序处理血浆药物浓度 时间数据。结果 ,健康鸡静脉注射给药的药时数据适合二室开放模型 ,主要药物代谢动力学参数为 :t1/ 2α=0 .6 9h± 0 .4 3h ;t1/ 2 β=6 .11h± 1.5 0h ;V1=1.70L/kg±0 .33L/kg ;Vd(area) =3.10L/kg± 0 .6 7L/kg ;ClB=0 .37L/ (kg·h)±0 .10L/ (kg·h) ;AUC =2 9.16 μg/ (mL·h)± 8.0 4 μg/ (mL·h)。健康鸡肌肉注射及内服给药的药时数据适合一级吸收一室模型 ,前者的主要药物代谢动力学参数为 :t1/ 2Ka=0 .17h± 0 .12h ,t1/ 2Ke=5 .6 4h± 0 .74h ,tmax =0 .86h± 0 .4 0h ,Cmax =2 .5 1μg/mL± 0 .36 μg/mL ,AUC =2 2 .6 2μg/ (mL·h) ± 3.2 8μg/ (mL·h) ,F =77.0 %± 11.8% ;后者的药物代谢动力学参数为 :t1/ 2Ka=1.4 6h± 1.0 0h ,t1/ 2Ke=8.2 0h± 3.12h ,tmax=4 .34h± 2 .4 0h ,Cmax=1.0 0 μg/mL± 0 .2 1μg/mL ,AUC =15 .82 μg/ (mL·h) ± 3.6 7μg/ (mL·h) ,F =5 4.2 %± 12 .6 %。二氟沙星在健康鸡体内的主要药物代谢动力学特征为

猪源致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及抗菌药耐药性的调查

【目的】探讨猪大肠杆菌病分离的E.coli的优势血清型与毒力基因和耐药性的相关性。【方法】采用玻片凝集法测定了猪大肠杆菌病有关的血清型分布,PCR方法调查7种毒力相关基因,用微量稀释法测定了所有菌株对18种抗菌药的敏感性。【结果】超过一半的菌株含有astA,Stx2e和eaeA基因,且毒力基因组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行。定型菌株53株,分别属于15个不同的血清型,其中O8和O64为主要流行的血清型。O8型菌株中,所有均携带astA基因,多数耐四环素、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑,但对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感;而O64型菌株中,多数携带astA和Stx2e基因,所有对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑耐药,但对多黏菌素E和卡那霉素敏感。【结论】O8和O64为主要流行的血清型,两种血清型菌株拥有相似的毒力基因谱和耐药表型,但有不同的敏感表型。

液相色谱-质谱联用检测牛奶中氟喹诺酮类药物残留的确证方法

【目的】建立牛奶中诺氟沙星、氧氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等10种氟喹诺酮类药物残留检测的液相色谱-大气压化学电离-离子阱质谱确证方法。【方法】牛奶经三氯乙酸和乙腈沉淀蛋白、聚合物反相Strata-X固相萃取柱净化、ODS2分离后,用大气压化学电离-离子阱质谱测定。【结果】对诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星等5种药物进行了定量方法学验证:在1.0～100.0ng·ml-1范围内线性良好(r>0.99);以1.0、10.0、100.0ng·ml-1浓度水平的添加回收率为60.6%～101.0%,日内变异系数≤17.5%,日间变异系数≤22.1%;检测限为0.2～0.8ng·ml-1,定量限为0.8～2.8ng·ml-1。【结论】此方法为一种检测氟喹诺酮类药物在牛奶中残留的高通量确证分析方法。

阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学和药效动力学关系

建立了体外药代动力学和药效动力学（PK-PD）模型，测定了阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学参数和药效动力学参数，并研究了它们之间的关系.结果表明，T〉最低抑菌浓度（MIC）是衡量阿莫西林药效的关键指标，当阿莫西林浓度超过MIC时，初始浓度0．4～3．29g／mL对杀灭金黄色葡萄球菌的药效没有影响。在消除半衰期为2h的模型内，T〉MIC在7．40h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果；在消除半衰期为5．5h的模型内，T〉MIC在11．76h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果。