香蕉种质超低温保存技术研究进展

对于香蕉这种营养繁殖的植物,超低温保存是长期有效地保存其种质的一种有效方法。主要综述了香蕉胚性悬浮细胞系、合子胚和茎尖分生组织的超低温保存技术方面近十几年来的研究进展。总结了影响香蕉超低温保存效果的几个主要因素,主要包括材料、预处理、装载处理以及冰冻保护剂。并分析了当前应用在香蕉分生组织上的4种超低温保存方法的优缺点,分别为:分生组织团简单冻存法、分生组织团玻璃化法、单个分生组织玻璃化法、滴冻玻璃化法,认为滴冻玻璃化法效果最好。

监测和净化难分解性有机污染物质的植物基因工程技术

介绍了植物基因工程技术在监测和净化难分解性有机污染物质方面的研究进展。生物中存在着能降解难分解性有机污染物质的酶及其编码基因,具有识别和除去难分解性有机污染物质的免疫系统、受体和响应元件。这方面的研究工作多以哺乳动物为材料,植物的相关研究还处于起步阶段。创造环境监测和环境污染净化为目标的新型植物将成为转基因植物研究的极其重要的研究方向之一。

枇杷LEAFY同源基因的克隆及序列分析

为从分子水平研究枇杷成花的机理,通过分析植物花分生组织决定基因LEAFY(LFY)同源基因的保守区序列,设计了1对简并引物,用PCR方法从枇杷栽培品种‘早钟6号’基因组DNA中扩增出1个1317bp的片段,把该片段克隆到pUCm T载体,测序和序列分析结果表明获得了枇杷LFY同源基因(ejLFY) 3′端的1个片段,该片段有1个911bp的内含子,编码区共编码130个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号为AY5 5 1183) .在GenBank中进行同源性搜索,发现该基因片段与其他作物中已经报道的LFY同源基因的同源性大都在94 %以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到98%的同源性。

结球甘蓝NBS-LRR类R基因同源序列的分离

根据大多数抗病基因编码蛋白质的核苷酸结合区(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR)保守区域的特点,设计PCR特异简并引物,从抗TuMV的结球甘蓝材料84075中,扩增出513 bp的DNA片段,经克隆、测序后,得到4个含有NBS-LRR保守区域的R基因同源序列,分别命名为:Bor1、Bor2、Bor3和Bor4,同源性比较分析表明,它们与已克隆的抗病基因或抗病基因片段有不同程度的同源性。以Bor1为探针,对84075进行Southern blot和RFLP分析的结果表明,Bor1以多拷贝形式存在。

菠萝叶基愈伤组织诱导体细胞胚

以菠萝[Ananascomosus(L.)Merr.]吸芽上的叶基部组织为材料,研究了2,4-D、NAA、BA、TDZ在菠萝愈伤组织诱导体细胞胚过程中的影响。结果表明,2,4-D在体细胞胚诱导过程中起着极为重要的作用,其适宜浓度为5mg/L,适当浓度(1mg/L)的BA在降低畸形胚比例和增加体细胞胚发生率方面有重要作用,但BA也会促进愈伤组织分化不定芽;低浓度的TDZ与BA效果相似,在不同生长调节物质处理组合中,MS+0.01mg/LTDZ+5mg/L2,4-D培养基的体细胞胚发生率最高(97%)。低浓度NAA(2￣5mg/L)利于非胚性愈伤组织的增殖,而高浓度的NAA虽能促进体细胞胚发生,但这种体细胞胚很难继续增殖,在萌发时只生根不发芽。成熟体细胞胚在MS+0.2%活性炭上30d时的转株率为22.7%。

柑橘密码子用法分析

采用高频密码子分析法,对柑橘的177个蛋白质编码基因序列(codingDNAsequence,CDS)进行了分析,计算出同义密码子相对使用频率(relativefrequencyofsynonymouscodon,RFSC),确定了TAA、GCT、GAT、CTT、AGG、AGA和GTT等7个高频密码子。将柑橘的密码子使用频率与人、果蝇、酵母和大肠杆菌等不同种类模式生物比较后发现,柑橘密码子的偏爱性与不同种类生物有不同程度的差异;但将柑橘的密码子使用频率与拟南芥、番茄、水稻和尖叶蕉等不同种类的植物相比,发现柑橘密码子的偏爱性与同为双子叶植物的拟南芥、番茄完全一样,而与水稻、尖叶蕉这2种单子叶植物均有较大的差异。分析结果对动物或微生物的基因在柑橘中的表达或柑橘基因在微生物中的表达以及基因克隆时设计引物具有一定指导意义。

枇杷属植物基因组DNA提取方法的改进及其应用

以枇杷属的普通枇杷和多种野生枇杷的叶片为材料,对枇杷的DNA提取进行了研究。针对枇杷富含多酚类 等次生物质的特点对枇杷DNA的提取步骤进行了改良处理:采用CTAB-蛋白酶K法加重复抽提,去除枇杷材料中 的相关次生物质,获得了高质量的DNA。所提取的DNA完全能满足PCR、RAPD、AFLP等一些分子生物学实验要 求。

不同着色期荔枝果皮总RNA的提取及mRNA差显分析

以妃子笑和糯米糍2个主栽荔枝品种不同着色期的果皮为试材,经过大量的对比和筛选,采用改良Bugos法提取果皮中的总RNA,经核酸蛋白测定仪测定和凝胶电泳显示提取的总RNA完整性强,质量好,产率高(最高可达318.7μg/g),可用于RT-PCR等分子生物学实验。进一步的DDRT-PCR分析表明:高分辨力的cDNA片段在500～2 000 bp之间,不同品种、不同着色期的荔枝果皮,基因表达有较大差异。

荔枝类黄酮糖基转移酶(UFGT)基因的克隆及其原核表达研究

类黄酮糖基转移酶(UFGT)可以把不稳定的花色素催化成花色素苷,是花色素苷合成过程中的最后一个酶。在一定范围内,类黄酮糖基转移酶活性与花色素苷的合成呈现正相关,抑制UFGT酶活性比抑制其他酶更能影响花色素苷的合成。很多研究结果表明,UFGT是花色素苷合成的关键酶基因。本研究根据在荔枝上已知的UFGT基因片段,采用3′RACE和5′RACE技术克隆得到UFGT的全长cDNA。采用特异引物扩增得到该基因的基因组DNA的全长序列,发现该基因含有一个内含子。将该基因全长cDNA序列构建到原核表达载体pET32a中,通过1 mmol/L IPTG诱导表达,得到大约60 KDa的融合蛋白。

不同种类柑橘的密码子用法分析

采用高频密码子分析法,对甜橙C itrus sinensis、温州蜜柑C.unshiu、葡萄柚C.paradisi和柠檬C.lim on等4种柑橘的蛋白质编码基因序列(codon DNA sequence,CDS)进行了分析,计算出了柑橘同义密码子相对使用频率(rela-tive frequency of synonymous codon,RFSC),确定出了4种柑橘的高频率密码子,发现不同种类柑橘偏爱密码子稍有差别.

杧果主要品种遗传多态性的AFLP标记研究

采用扩增片段长度多态性AFLP标记对国内外31个杧果主要品种进行分类与亲缘关系研究。结果表明:筛选出的14对引物组合在31份杧果种质中共扩增出了1761条带,其中多态性带的比例为97%。平均每对引物产生125·8条带和121·6条多态性带,总的多态性带率为97%;基于AFLP标记,以0·48的相似系数为阈值,所有供试杧果材料被分为7大组群,第一组群内以0·52为阈值,又可分为6组。与形态标记相比,基于AFLP标记的杧果分类体系更能反映杧果品种间的亲缘关系。

芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立

采用农杆菌导入法,探讨了影响芥菜农杆菌遗传转化效率的因素,优化了参数,初步建立了以MS+6 BA(2 0mg/L)+NAA(0 2mg/L)为分化培养基,预培养时间3或4d,共培养时间4d,农杆菌浓度D600nm为0 5,浸菌时间10min,筛选压Kan为25mg/L的遗传转化体系.

TA29-barnase基因转化菜心

利用根癌农杆菌导入法,以菜心带柄子叶为外植体,对TA29-barnase基因转化菜心进行研究。获得转化植株,进行PCR、Southern blotting杂交和半定量RT-PCR检测,表明目的基因已经整合到转化植株中,并且目的基因在转基因植株花蕾中得到表达,但是表达水平在不同转基因植株间存在差别;转基因植株开花后,均表现雄性不育,不能产生花粉或产生没有活力的少量花粉,自交不能结实;用未转化植株正常花粉对雄性不育植株进行授粉,能够正常结实;保持系(未转化植株)与不育株杂交后代中雄性不育株与可育株的比例为1:1,在杂交后代植株子叶期,喷洒10mg/L的PPT可以完全杀死可育株;利用其他菜心品种为父本与不育株进行杂交,获得的F1植株在生长势和产量方面表现优势,表明开展菜心优势育种具有一定的潜力。

菠萝非胚性愈伤组织的类型及其器官发生

以菠萝[Ananas comosus(L.)Merr.]非胚性愈伤组织为材料,利用离体培养及组织细胞学等方法研究了其在增殖、分化过程中的特性和再生规律。在增殖培养基上经过3次以上继代培养后,非胚性愈伤组织形态上逐渐表现出一定差异。根据其形态结构、分化能力和组织细胞学特征,可把非胚性愈伤组织分为节瘤状组织、薄壁组织团、致密深层愈伤组织和表面疏松愈伤组织4种类型;在增殖培养基MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA上,一种类型的非胚性愈伤组织通常只会生长出同类型的非胚性愈伤组织,但通过改变培养基配方等方法可使不同类型之间发生转换。同时,增殖继代过程中的器官发生现象很常见,通常是在薄壁愈伤组织表面细胞分化成具有分生能力的细胞,然后进行不定芽的分化。4类非胚性愈伤组织都可以通过拟原球茎、多芽体以及不定芽的形式进行器官发生;也可以经胚性诱导由体细胞胚发生途径再生成植株,其中拟原球茎产生体细胞胚的能力最强,多芽体其次。生长素及细胞分裂素对非胚性愈伤组织的形态结构、分化途径以及增殖能力有很大的影响。

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。

由ACC合成酶反义基因转化所得枣树其RNA表达量的测定

利用real timeRT PCR对转基因枣树中的anti ACSG的RNA表达量进行了定量测定.样品扩增产物荧光量随着扩增循环数的增加而呈现"S"形增加;经熔解曲线分析,其扩增产物中未检出非特异性产物和引物二聚体;扩增产物的CT值和模板cDNA起始浓度两者之间呈线性相关(R2=0.9929);转化体中anti ACSGRNA表达量约为4500～10300拷贝/g组织.

普通枇杷和栎叶枇杷APETALA1同源基因的克隆和序列分析

分析植物花分生组织特征基因APETALA1(AP1)同源基因的保守区序列,设计特异引物;用PCR方法从枇杷栽培品种香钟11号和野生种栎叶枇杷基因组DNA中各扩增出1个350 bp左右的片段;将该片段分别克隆到pUCm-T载体.测序和序列分析结果表明获得了枇杷AP1同源基因的片段.该基因片段的序列在2个不同种的枇杷间差异较小,均含有2个内含子,特别是外显子部分只有1个碱基的差别;编码区共编码36个氨基酸,氨基酸序列也只有1个氨基酸的差异.其序列已经在GenBank中登记(登录号分别为AY549306和AY571786).同源性比较发现该基因片段与其他作物中已经报道的AP1同源基因的同源性大都在80%以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到91%(栽培种)和94%(野生种),推测它们具有相似的功能.

根癌农杆菌介导反义ACC合成酶基因对枣树的转化

以枣树鲜食品种鸡蛋枣为材料,通过根癌农杆菌介导ACC合成酶反义基因转化,得到了转基因植株.预培养1d的枣树幼嫩茎段经根癌农杆菌感染后共培养3d,转移至分化选择培养基MS(1/2NO3)+0.15mg/LNAA+1.75mg/LZT+10mg/LKm+500mg/LCarb上诱导产生不定芽,将抗Km不定芽先后在15mg/LKm的生长、增殖和生根培养基上继续选择,诱导成完整植株.经PCR检测从抗Km植株中选择到7株阳性植株,进一步经Southern杂交证实有6株外源基因已整合到了枣树基因组中.Real timePCR定量检测表明,ACC合成酶反义基因在5株转基因植株中得到表达.

枇杷LFY同源基因植物表达载体构建及其功能分析

为研究枇杷LFY同源基因的功能,构建了含枇杷LFY同源基因ejLFY的植物表达载体pBI121-ejLFY,并转入到农杆菌GV3101中。利用花序侵染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了25个转化株系。与对照相比,大部分转基因植株明显早花,成花时间可提早1周左右,莲座叶数目减少2-3片;部分植株侧生花序全部转变成单独的花,从莲座叶中抽出的花枝也全部转变为单独的花;少量转化株系花器官异常,不能形成种子。这表明枇杷LFY同源基因在其成花过程中起重要作用,为了解枇杷的成花分子机制奠定了基础。

根癌农杆菌介导的枣树遗传转化系统的建立

经比较影响根癌农杆菌介导ACC合成酶反义基因转化枣树的各种因素后 ,建立了稳定的转基因实验体系。预培养 2d的枣树嫩梢段和下胚轴经根癌农杆菌感染后共培养 3d ,转移至分化选择培养基MS (1/2NO3) +0 15mg/lNAA +1 75mg/lZT +10mg/lKm +5 0 0mg/lCarb上诱导产生不定芽 ,将抗Km不定芽先后在 2 0mg/lKm的生长培养基和 30mg/lKm生根培养基上继续选择 ,诱导成完整植株 ,转化率为 2 % - 4%。经PCR检测和Southern杂交证实有 6株外源基因已整合到了枣树基因组中。