以培养从业人员为导向的实验动物学课程改革与实践——以华南农业大学为例

为提高实验动物学教学质量,增加课程趣味性和实用性,本文以华南农业大学为例,结合农业院校的特点,系统分析了实验动物学课程改革的重要性,提出了以培养从业人员为导向的实验动物学课程改革方向,归纳了具体的改革内容、方式、评价手段及实施效果,以期培养具备理论知识和实操能力的学生,建立良好的教育环境,在为农业院校科研做好支撑的同时,为学生提供新的就业方向。

高校实验动物中心的定位和创新发展

实验动物是生命科学研究的基础和条件,是衡量一个国家、一个地区、一个大学生命科学研究水平高低的标志之一,高校实验动物中心的发展应与现代生命科学、医药研究的需要相适应。为了更好推动高校实验动物工作,解决高校实验动物中心在新时期条件下的发展困惑,本文探讨了高校实验动物中心应当具备的职能、定位和发展方向以及存在的一些问题,提出了高校实验动物中心一个中心工作点,两个平台着力点,三个服务拓展点和四个创新发展点的工作思路,提出了走学科建设道路,加强平台建设的发展模式。

动物体细胞克隆与转基因技术科普需求及认知度调研分析

当前,社会上存在着对“克隆”“转基因”的误解。为使民众对克隆和转基因有科学性的认知,本研究采取问卷调查的方式,获取公众对当前体细胞克隆和转基因技术的认知水平与态度的数据,以期为相关的科普活动提供参考。

猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性分析

【目的】在昆虫细胞表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap),并对表达的重组蛋白~*Cap进行免疫原性分析。【方法】将含有PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-ORF2转染昆虫细胞进行蛋白表达试验,再用纯化的~*Cap和质粒pcDNA3.1-ORF2分别免疫小鼠,比较二者的免疫效果。【结果】由PCV2-ORF2基因编码的Cap结构蛋白在昆虫细胞中正确表达,相对分子质量约为32 000。~*Cap能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。~*Cap免疫组在细胞免疫水平及体液免疫水平的免疫效果均优于pcDNA3.1-ORF2免疫组。【结论】重组蛋白~*Cap可替代全病毒,具有PCV2疫苗潜在的应用价值。研究结果为后续的PCV2病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定试验基础。

一例犬股骨骨折的手术治疗

通过询问病史、术前检查、X线检查等方法对1只3月龄阿拉斯加幼犬股骨骨折进行诊断,并采用髓内针结合钢丝内固定手术进行治疗,术后经输液、抗感染等综合治疗调养,犬只病情得到明显改善,1个月后基本可以正常行走。

长期高铜暴露通过影响线粒体自噬和细胞焦亡诱导大鼠肝组织损伤

旨在探索高铜对大鼠肝组织损伤的作用机制。试验选取120只SD大鼠随机分为对照组、高铜I组、高铜Ⅱ组、高铜Ⅲ组和高铜Ⅳ组,分别连续每天按体重灌胃0、20、40、80、160 mg·kg^(-1)铜63 d,采集肝组织。使用ICP-MS测定肝组织铜含量,病理切片观察肝组织病理变化,透射电镜观察线粒体形态和线粒体自噬小体,RT-qPCR和Western blot检测肝组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、Pink1、Parkin、LCB3、p62的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,随着灌胃铜水平的增加,蓄积在肝组织中的铜含量呈剂量依赖性增加,且长期高水平铜暴露会造成明显的肝组织结构破坏;随着铜暴露水平的增加,线粒体自噬和细胞焦亡水平呈先上升后下降趋势;与对照组相比,高铜Ⅱ组、Ⅲ组中PINK1和LC3II/LC3I的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),高铜Ⅱ组中p62的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),高铜Ⅲ组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),高铜Ⅳ组表现为下调。高铜长期暴露可通过影响线粒体自噬和细胞焦亡诱导大鼠肝组织损伤。

^(68)Ga标记的磁性铁氧体纳米颗粒PET/MRI双模态显像探针的制备及研究

【目的】制备^(68)Ga标记的磁性锰铁氧纳米颗粒PET/MRI双模态显像探针,考察其作为前列腺癌显像新型分子探针的可能。【方法】以超顺磁锰铁氧纳米粒子为核心,利用成纤维激活蛋白抑制剂和羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)修饰,螯合正电子放射性核素^(68)Ga,制备出纳米探针^(68)Ga-DOTA-UMFNPs-FAPI-04。对纳米探针进行基本表征,分析其细胞毒性、放射化学纯度和稳定性。观察纳米探针在正常小鼠的体内分布和对荷瘤鼠的MRI显像效果。【结果】经纯化后,^(68)Ga-DOTA-UMFNPs-FAPI-04放化纯为94%,稳定性良好。MRI T2测试显示其T2弛豫率约为39.02 mmol^(-1)·s^(-1)。正常鼠体内分布显示,^(68)Ga-DOTA-UMFNPs-FAPI-04在肝脏、脾脏的放射性摄取较高。MRI显像显示,荷瘤鼠经尾静脉注射纳米探针后30 min,肿瘤部位可观察到摄取。【结论】成功构建PET/MRI双模态显像探针^(68)Ga-DOTA-UMFNPs-FAPI-04,具有MRI T2造影剂特性,对小鼠前列腺肿瘤MRI显像良好,具备PET显像潜力。该研究为构建前列腺癌多模态成像探针提供了一个新的思路。

鸭坦布苏病毒的研究进展

鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的一种以产蛋鸭产蛋量下降和雏鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的传染性疾病。2010年在我国江浙地区首先暴发,随后迅速波全国主要养鸭省份,给我国的养鸭业造成了极大的经济损失。本文主要从生物学特征、传播途径、流行病学、临床症状、诊断等方面阐述该病毒的最新研究进展,为其相关研究提供参考。

MC38结肠癌小鼠肿瘤浸润免疫细胞的动态变化

目的观察荷瘤小鼠肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤发展过程中的动态变化。方法将小鼠结肠癌MC38细胞移植到24只C57BL/6J小鼠皮下,荷瘤后每周一次记录小鼠体质量及肿瘤大小的变化,每周一次采用流式细胞术检测肿瘤浸润免疫细胞水平,包括CD45^(+)细胞、CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞、树突状细胞、巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、单核样髓源抑制细胞(monocytic-MDSC,M-MDSC)、粒样髓源抑制细胞(granulocytic-MDSC,M-MDSC),共检测4周。结果随着小鼠结肠癌肿瘤的增长,CD45^(+)细胞水平总体表现出下降趋势,CD8^(+)T细胞水平稳步下降至不可逆的水平,而CD4^(+)T细胞比例在荷瘤早期迅速增长,单位体积中浸润细胞数增长了近8倍,肿瘤浸润的T细胞几乎为CD4^(+)表型。以NK细胞为代表的非特异性免疫应答水平持续下降,而树突状细胞在肿瘤内持续累积,并通过激活精氨酸酶1(Arginase-1,ARG1)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS),进一步加深免疫抑制作用。巨噬细胞浸润水平整体无显著变化,但Ⅰ型巨噬细胞浸润细胞数的下滑速度显著高于Ⅱ型。单位体积肿瘤内MDSC数未出现下降趋势,在肿瘤内持续累积;其中G-MDSC浸润水平呈稳降趋势,M-MDSC浸润水平持续上升,且占比远高于G-MDSC。结论小鼠移植MC38结肠癌细胞后,肿瘤组织内免疫细胞浸润水平整体下降,促肿瘤免疫逐渐占据主导地位,从而促进结肠癌的发展。肿瘤内产生了Th1/Th2漂移现象,特异性和非特异性免疫应答水平均显著降低,浸润的单核细胞和粒细胞主要是Ly6C^(+)表型。肿瘤相关树突状细胞和巨噬细胞发挥了重要的免疫抑制作用,CD4^(+)T细胞和M-MDSC可能是发挥促肿瘤免疫效应的关键点。

中药调节肠道菌群降低血糖的作用及机制研究进展

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种威胁患者健康的代谢性疾病,现代医学以控制血糖稳定与预防并发症为主要治疗手段,患者需要终生服用降糖药。化学药疗效确切,但长期服用后容易引发系列的副作用,严重的限制了其推广和使用。中药(Traditional Chinese Medicine,TCM)降血糖的历史悠久,在T2DM这类复杂疾病的治疗中独具优势,但其作用机制尚不十分清楚。最新研究表明,TCM可以通过调节肠道菌群来改善葡萄糖代谢从而降低血糖,这给T2DM的防治提供了新的方法和思路。本文综述TCM及其有效成分、复方制剂通过调节肠道菌群降低血糖的作用及机制最新进展,为后续开展TCM降血糖研究提供参考和建议。

益生菌降胆固醇作用及其机制研究进展

心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)严重威胁人类的健康,《2017年中国心血管病报告》显示,因CVD死亡的人数已占据我国居民疾病死亡的40%以上[1],2005—2015年因CVD造成的直接经济损失更是达到5500亿美元以上[2]。CVD的主要危险因素有动脉粥样硬化、冠心病和中风等,而这些危险因素都与高胆固醇血症密不可分,流行病学研究结果也表明,总胆固醇与CVD的发病呈正相关,降低血清胆固醇水平可显著降低心血管疾病的发病风险。

高脂血症食蟹猴模型的建立及初步分析

目的建立与人类疾病特征相似的高血脂食蟹猴模型,为降脂药(特别是生物类降脂药)的研发提供理想的动物模型。方法将优化、定型的半流质高糖高脂膳食乳剂,每周6 d经鼻饲灌喂给药处理组雄性食蟹猴,定期监测猴体重(BW)、体重质量指数(BMI)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等指标,对其血脂指标的变化趋势进行分析。结果与相应的对照组相比,至造模第3个月,处理组6只中老年雄性食蟹猴和5只成年雄性食蟹猴全部造模成功,至造模第21个月所有处理组雄性食蟹猴依然维持在较高血脂水平。结论连续3个月定量灌喂半流质高糖高脂膳食乳剂可成功制备高脂血症食蟹猴模型,该模型具有高胆固醇血症和高低密度脂蛋白胆固醇血症的特征,可用于高脂血症发病机理研究及药物临床前药效评价研究。

糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的研究

目的:研究糖尿病模型大鼠造模后不同时间段骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的成骨及成脂分化能力的改变,探讨糖尿病模型骨质疏松形成与BMSCs成骨及成脂分化能力的相关性。方法:利用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)加高糖高脂饲料诱导制作大鼠糖尿病模型,正常大鼠作为对照组。分别于注射STZ液4、8、12周后,利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化BMSCs,取生长良好的第3代细胞作为本实验的研究对象。用成骨诱导液诱导细胞分化,培养7 d后,检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活力,14 d后,进行茜素红染色及检测ALP和骨钙素(Osteocalcin, OC) mRNA含量。用成脂诱导液诱导细胞分化,诱导14 d后,进行油红O染色,计算脂肪细胞转化率;进行油红O染色定量分析;检测脂蛋白脂酶(Lipoprotein Lipase, LPL)和过氧化物酶增殖活化受体(Peroxisome Proliferator Activated Receptor, PPARγ2) mRNA含量。结果:注射STZ液8、12周后,糖尿病组ALP活力明显下降,与对照组比较,P <0.01。对照组钙化结节数量明显多于糖尿病组。ALP基因相对OD值,糖尿病组(0.26 ±177;0.05)低于对照组(0.42 ±177;0.09),P <0.01。OC基因相对OD值,糖尿病组(0.31 ±177;0.09)低于对照组(0.41 ±177;0.06),P <0.05。注射STZ液4、8、12周后,油红O染色,对照组、糖尿病组镜下观察可见有红色脂滴,对照组脂肪细胞转化率(25.16 ±177;5.03)明显低于糖尿病组(66.85 ±177;10.01),P <0.01。油红O染色定量分析结果(OD值),对照组(0.016 ±177;0.015)油红含量明显低于糖尿病组(0.058 ±177;0.016),P <0.01。LPL基因相对OD值,糖尿病组(0.89 ±177;0.05)高于对照组(0.22 ±177;0.05),P <0.01。PPARγ2基因相对OD值,糖尿病组(0.38 ±177;0.03)高于对照组(0.18 ±177;0.01),P <0.01。结论:注射STZ液4周以后,糖尿病大鼠BMSCs成脂分化能力增强;8周以后,成骨分化能力明显下降,可能与骨质疏松的形成有一定的关系。

狂犬病认知现状调查分析与防控对策

为了解民众对狂犬病及其防控科普知识的认知度和需求情况,以制定切实有效的防控对策,本研究采取问卷调查的方式,获得公众对当前狂犬病的认知水平与态度等情况,并进行统计分析,根据公众对狂犬病及其防控技术需求和认知水平基础数据,提出对狂犬病的科学防控建议和对策。

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞体外培养观察及其增殖能力检测

目的:研究糖尿病模型大鼠不同时间段体外培养条件下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖能力的改变,初步探讨糖尿病模型骨质疏松形成与BMSCs生物学特性改变的相关性。方法:利用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)加高糖高脂饲料诱导制作大鼠糖尿病模型,正常大鼠作为对照组。分别于注射STZ液4、8、12周后,体外利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化BMSCs,取生长良好的第3代细胞作为本实验的研究对象。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD34、CD29的表达。采用 Cell Count kit-8 (CCK-8)分别绘制细胞的生长曲线来评价增殖能力。结果:培养的细胞CD29表达为阳性,CD34表达为阴性。注射STZ液4、8、12周后,来源于糖尿病大鼠的BMSCs的增殖均较正常的大鼠显著性减慢(P 0.05。结论:糖尿病大鼠来源的BMSCs可以成功地在体外进行增殖培养,但是随着时间的增加,其在增殖能力生物学性状上有不同程度的损害。糖尿病大鼠BMSCs 的增殖影响可能具有一定的时间依赖性,可能与骨质疏松的形成有一定的关系。

高敏与普通荧光定量PCR技术在不同病毒载量慢乙肝患者HBV-DNA检测的一致性及应用价值

目的比较高灵敏度与普通荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)定量检测结果的相关性与一致性。方法收集2020年8月-2021年6月中山大学附属第三医院感染性疾病科门诊患者的血浆标本511份。以Bland-Altman图分析2种检测方法间绝对与相对偏差,以组内相关系数(ICC)评价方法间一致性。高敏法HBV-DNA检出率与临床指标的关系用χ^(2)检验分析。结果在收集的511份慢性乙型肝炎(CHB)患者样本中,高灵敏度与普通荧光定量PCR法在<2×10^(3)、2×10^(3)~<2×10^(6)和2×10^(6)~IU/mL组的ICC分别为0.54、0.80和0.66,差异有统计学意义(P<0.05)。Bland-Altman法也显示类似的结果。对于HBV-DNA低于检测下限(普通PCR法)的样本,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)≥1000 IU/mL、丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常和未治疗的高灵敏度法检出率显著高于HBsAg<1000 IU/mL、ALT正常和抗病毒治疗(χ^(2)=6.67、5.00、30.51,P均<0.05)。结论普通荧光定量PCR法与高灵敏度法HBV-DNA结果存在差异,且在低病毒载量的样本中,两种方法的一致性较低。对于低水平病毒血症、普通法HBV-DNA检测低于检测下限、ALT异常、HBsAg≥1000 IU/mL、尚未进行抗病毒治疗的CHB患者,建议使用高灵敏度HBV-DNA进行检测。

猪圆环病毒2型ORF2基因在Vero细胞中真核表达的研究

为了研究猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）ORF2基因在Vero细胞中的表达情况,试验利用PCR方法将扩增的PCV-2 ORF2基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）上,构建重组表达质粒pcDNA-ORF2,测序后对4株毒株的ORF2基因进行核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性比较分析,并分别采用磷酸钙法和脂质体法将重组表达质粒pcDNA-ORF2导入哺乳动物Vero细胞内,通过间接免疫荧光试验验证重组表达质粒在Vero细胞中的表达情况。结果表明：PCR方法成功扩增出4株PCV-2毒株的ORF2基因;成功构建出重组表达质粒pcDNA-ORF2;4株毒株的ORF2基因核苷酸序列同源性在98.6%-99.1%之间,推导氨基酸序列的同源性在97.4%-98.7%之间;间接免疫荧光试验检测到Vero细胞内发出绿色荧光。说明重组表达质粒pcDNA-ORF2在Vero细胞中得到了正确表达。

猪源CD163受体蛋白多克隆抗体的制备及其PRRSV阻断效力研究

为了制备猪源CD163受体蛋白鼠源多克隆抗体并检验其病毒阻断效力,采用RT-PCR方法扩增了猪肺泡巨噬细胞(PAM)CD163受体SRCR4-6功能区域片段,将其克隆至载体pET-32a中,并在大肠杆菌中表达重组CD163受体蛋白,纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化;采用皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,应用间接ELISA方法检测抗体含量,以病毒阻断试验和间接免疫荧光法验证其病毒阻断效力。结果显示:重组蛋白主要以包涵体的形式表达,相对分子量约为50 kDa,制备的CD163受体蛋白多克隆抗体含量较高,经2~8倍稀释后,抗体阻断PRRSV感染细胞的能力逐渐下降。研究表明,在大肠杆菌中成功表达了PRRSV重组CD163受体蛋白,制备的鼠源多克隆抗体具有较明显的阻断PRRSV感染细胞的效力。本研究为深入研究病毒的入侵机制和PRRSV的防控提供了试验基础和新的思路。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白鼠源多克隆抗体并检验其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的Nsp9基因保守区域片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组Nsp9蛋白;纯化后的重组Nsp9蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化,采用皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光试验检验其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为951 bp的Nsp9基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-28a-Nsp9构建成功;重组Nsp9蛋白的分子质量约为36.0 ku;制备的多克隆抗体效价较高,重组Nsp9蛋白多克隆抗体经2~8倍倍比稀释时,与PBS对照相比荧光数量递增。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组Nsp9蛋白,制备的鼠源多克隆抗体有一定的抗PRRSV中和活性。