寡核苷酸芯片检测兽医病原菌耐药性的研究

利用寡核苷酸芯片(oligonucleotide array)对兽医临床常见病原菌耐药性检测进行了初步研究。设计1对兼并引物扩增3种病原菌(E. coli、S. aureus、M. gallisepticum)的gyrA基因片段,并用cy5-dCTP标记荧光。设计一系列检测病原菌对氟喹诺酮类药物耐药的寡核苷酸探针,将探针固定在APS-PDC法制作的Microarray上,用标记的PCR产物与之杂交,置于Scanarrray4000中扫描,利用ImaGene3.0软件对杂交图像进行分析。研究结果表明,设计的兼并引物能很好地扩增出3种病原菌的gyrA基因片段,与Microarray杂交后在相应的位点出现可检测的杂交信号,样本O78S(禽大肠杆菌)、SS(金黄色葡萄球菌)、S6-10(鸡毒支原体)的ratio比值均≥2,说明这3株是敏感株;样本EDr(犬大肠杆菌)、ECr(猫大肠杆菌)与a1探针(检测GyrA第83位氨基酸发生突变的探针)的ratio比值≤0.5,说明这两株是耐药突变株,均与样本的实际情况相吻合。说明利用Oligonucleotide array能快速准确地检测出GyrA亚基第83、87位发生突变的耐药菌株,是可行、有效、快捷的抗菌药耐药性的监测方法。本研究为进一步研制和开发兽医临床常见病原菌耐药性检测芯片打下初步基础。

抗微生物药物PK-PD研究在优化兽药给药方案中的应用

PKPD模型可用于优化兽药给药方案,制订合理的给药间隔和剂量,在减少细菌耐药性方面有重要意义。本文综述了β内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类等抗微生物药物的PKPD研究现状,以期为兽药厂家在药物开发、设计合理的剂型与给药方案方面提供依据。

应对细菌耐药策略研究进展

细菌耐药性与畜牧产业发展、人类公共卫生安全和食品安全密切相关。细菌产生耐药的机制复杂,除由人-动物-环境三者之间复杂作用引起外,抗生素的使用对细菌耐药性的产生和传播具有非常重要的影响,需要采取多种策略应对细菌耐药性的产生。新发展的药物理论及分子生物学等技术的兴起,极大地推动了对细菌耐药机制的认识、新型抗菌药物的发现及药物的合理使用,为控制细菌耐药性的产生提供了重要的理论依据和技术手段。当前,细菌耐药性已然是不可忽视的严重问题,引起了多方关注。细菌耐药机制的复杂性及新药研发的困难性,决定了必须通过多种方法、多种途径和多种角度开展研究,从而控制其进一步发展。基于目前的研究现状,笔者归纳总结了多种应对细菌耐药的策略及方法,重点从新型抗菌药的研发、联合用药、药代动力学-药效动力学同步模型及多组学技术等方面阐述其在应对细菌耐药性方面的作用,以期为减缓和控制细菌耐药性的产生及临床治疗细菌感染提供参考和指导。

不同地区猪源和禽源大肠杆菌耐药性监测

2003--2005年自我国6省1市分离鉴定出133株猪源和455株禽源大肠杆菌临床株．采用微量肉汤稀释法测定了对20种抗菌药物的敏感性．结果表明，无论猪源还是禽源大肠杆菌对12种喹诺酮类药物耐药率非常高（耐药率范围34．96％-96．71％），对8种非喹诺酮类药物（除阿米卡星呈较低的耐药率外）也呈较高的耐药率（22．42％-94．07％）；多重耐药现象十分严重，3耐及3耐以上菌株占总菌株94％以上；不同地区来源菌株的耐药模式总体一致，但存在耐药水平高低的差异．

细菌耐药性扩散的机制

细菌耐药性是 2 0世纪留给医学的难题。自然界中各种细菌广泛存在 ,相互联系 ;细菌具有多种在种内或种间进行自主转移或诱动转移的遗传因子如质粒、转座子、噬菌体等 ;质粒、转座子上还有募集和表达外源基因的整合子 ;在不断变化的环境中 ,细菌的质粒、转座子、噬菌体等通过接合、转化及转导等方式 ,相互间交换所携带的一些基因 ,可使菌群更好地适应环境。这是细菌在长期进化过程中所获得的生存本领。耐药基因最初可能起源于少数抗生素产生菌或细菌自身基因的随机突变 ,在抗生素广泛应用所形成的选择压力胁迫下 ,没有机会获得耐药基因的细菌不得不退出竞争 ,而有机会通过菌间交换获得耐药基因的细菌却能自如地生存、繁衍成为耐药亚群。在抗生素选择压力的持续胁迫下 ,交流 -选择过程不断重复 。

鸡毒支原体不同地区分离株对常用抗菌药物的敏感性试验

从广东、四川和北京等地疑似鸡毒支原体感染鸡中分离并利用种特异性基因(fMG-2)PCR方法鉴定了51株鸡毒支原体,并测定了这些分离株对常用抗菌药物的敏感性。结果表明,三个地区临床分离鸡毒支原体对泰乐菌素仍然保持较好的敏感性,可作为鸡毒支原体感染的首选药物。三个地区的鸡毒支原体对林可霉素和庆大霉素敏感性显著下降,广东、四川两地分离株对强力霉素也有明显耐受性,部分广东分离株对氟喹诺酮类药物敏感性显著下降。

氟喹诺酮类药物(FQs)耐药性产生的分子机制

随着氟喹诺酮类药物的广泛使用,细菌对该类药物产生耐药性日趋严重,这引起了国内外的高度重视。本文就FQs耐药性产生的分子机制,即药靶的改变,药物在菌体内蓄积浓度下降及由质粒介导的耐药等机制做了综述。

恩诺沙星对土壤细菌数量及耐药性的影响

兽药吸收进入动物机体后,少部分药物将残留于动物组织细胞内,而大部分药物将排泄到体外,最终进入生态环境中,且可能造成环境污染。为了解恩诺沙星在环境中残留对土壤细菌的影响,在恩诺沙星作用于土壤后第35天,对纯培养法分离的土壤细菌进行了计数,并对土壤细菌进行了抗菌药物敏感性试验。结果表明,添加药物组的细菌总数均低于空白对照组,且药物浓度越高,细菌数量越少;在供试的19种抗菌药中,恩诺沙星敏感菌对其中的16种药物的敏感性均显著高于恩诺沙星耐药菌(P<0.01)。

基于彗星实验的洛克沙胂对秀丽隐杆线虫胚胎细胞DNA损伤的研究

为评价洛克沙胂的遗传毒性,采用单细胞凝胶电泳(彗星实验),研究了不同浓度的洛克沙胂对秀丽隐杆线虫胚胎细胞脱氧核醣核酸(DNA)的损伤作用。提取秀丽隐杆线虫的胚胎细胞,分别暴露于0(空白对照)、50、250、500μg·L^(-1)含洛克沙胂的溶液染毒1 h。用彗尾DNA百分比含量(TDNA%)、彗星尾长(TL)和Olive尾矩(OTM)作为DNA损伤的指标。实验结果表明,与空白对照组比较,处理组中彗尾DNA百分比含量、彗星尾长以及Olive尾矩显著增加(P<0.01)。随着洛克沙胂浓度的增加,彗尾DNA百分比含量、彗星尾长以及Olive尾矩逐渐增加,其相关系数r>0.99,说明在实验浓度范围内,存在极显著的浓度-效应关系。洛克沙胂对秀丽隐杆线虫胚胎细胞DNA具有损伤作用,彗星实验操作简便、快速、灵敏度高,能够反映出洛克沙胂的遗传毒性。因此,通过彗星实验建立实验室检测洛克沙胂遗传毒性的方法具有可行性。

硫酸黏菌素对土壤细菌耐药性的影响

为了解硫酸黏菌素在环境中残留对土壤细菌的影响,本试验建立土壤生态模型,施加不同浓度硫酸黏菌素,并在作用于土壤的14 d、35 d、70 d分别采集土壤,采用琼脂稀释法进行细菌对硫酸黏菌素的敏感性试验,采用药敏纸片扩散法进行细菌对抗菌药物的敏感性试验。结果表明,随着硫酸黏菌素施加浓度的逐渐增大,耐药菌数量逐渐增多;19种抗菌药中,硫酸黏菌素敏感菌对其中10种抗菌药的敏感性极显著高于硫酸黏菌素耐药菌（P〈0.01）。

多重耐药大肠杆菌中前噬菌体的分布特征及诱导分离

【目的】通过调查前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中的分布特征、诱导分离以及前噬菌体中耐药基因与毒力基因的流行状况,为研究前噬菌体介导耐药基因在细菌的传播提供科学依据。【方法】挑选前期保存的2018-2019年广东省分离的131株禽源多重耐药大肠杆菌进行核酸提取及全基因组测序,将二代测序的结果组装拼接成全基因组序列,上传至噬菌体PHASTER网络数据库与数据库中已有的噬菌体基因组序列进行比对分析。利用CGE数据库比对耐药基因与毒力基因,从而获得在前噬菌体上耐药基因与毒力基因的分布情况。温和性噬菌体由丝裂霉素C诱导并使用双层平板法分离纯化。【结果】131株大肠杆菌药物敏感性试验的结果显示,氨苄西林、四环素、氟苯尼考、复方新诺明的耐药率均高达90%以上,其次是头孢类抗生素以及庆大霉素、环丙沙星、美罗培南和黏菌素均在50%左右,替加环素的耐药率达到了0.2%,所有菌株都呈现出多重耐药的现象,均为多重耐药大肠杆菌。131株多重耐药大肠杆菌中共检出736个前噬菌体片段,其中包含329个完整型前噬菌体,其与40个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上;可疑型噬菌体有66个,其与20个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上;不完整型噬菌体有341个,其与52个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上,完整型前噬菌体的基因序列显示出与已知的噬菌体物种的序列相似性最高,平均为58.53%;131株大肠杆菌中平均前噬菌体数量为5.6个,平均总含量为152.4 kb。前噬菌体基因组占其宿主基因组的比例分布在0.58%-5.87%,以3.0%为主。前噬菌体基因组长度范围在2.8-107.9 kb,其中13.0 kb的前噬菌体出现的频次最高,占所有前噬菌体的9.1%。CGE比对结果表明,131株多重耐药大肠杆菌的基因组共在18株前噬菌体序列检测到耐药基因mdf(A)、lnu(G)和mcr-1,其中mdf(A)、lnu(G)和mcr-1检出数分别为16、1和1。71株多重耐药大肠杆菌前噬菌体中携带有6种不同的毒力基因,其中存在部分菌株携带2种或者3种毒力基因,有62株前噬菌体携带端粒酶RNA基因terC,16株前噬菌体携带血清存活率增加基因iss,外膜蛋白酶ompT、黏附素基因iha、cvaC和ABC转运蛋白基因mchF分别在2、2、1和1株前噬菌体中检出。mdf(A)和terC分别是前噬菌体中最常见的耐药基因和毒力基因。温和性噬菌体诱导试验结果显示,前噬菌体的诱导成功率为84.0%,但出现噬菌斑的概率仍比较低。【结论】前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中分布广泛且携带有多种耐药基因和毒力基因,温和性噬菌体诱导成功率高,具有携带耐药基因及毒力基因水平传播的风险,需要加强和持续监测。

有机胂饲料添加剂对猪场周围及农田环境污染的调查研究

对广东省长期使用阿散酸为饲料添加剂的15个大型猪场的周围环境及农田进行了调查，结果表明：猪场内长期施用猪粪为肥料的甘薯根内的总砷含量已为国家规定最高检出限（0．5mg／kg）的3—6倍；甘薯地土壤的砷含量介于25．83～55．54mg／kg，远远大于自然界最高砷含量的背景值（15mg／kg）；而且甘薯的各种组织的总砷含量与土壤砷含量成正比。绝大多数猪场鱼塘水的砷含量已超过渔业水质标准0．05mg／L；虽然鱼肌肉的总砷含量未超过国家规定标准0．5mg／kg，但是在鱼的可食性组织脂肪、脑的总砷含量却远远超标，约为肌肉组织中3-4倍。猪场排污口附近的土壤，砷污染范围介于200—500m之间；其中在距排污口约5m,50m的土壤，砷的含量远超过自然界的砷含量的最高背景值15mg／kg。长期施用猪粪作为肥料的稻田，大多数土壤砷含量已超过国家规定的最高标准；另外，水稻有一定的砷富集能力，而且水稻各种组织的砷含量与土壤的砷含量也存在明显的正相关。

高效液相色谱电化学检测法测定猪组织中的克伦特罗

建立了猪组织中克伦特罗的高效液相色谱 电化学检测方法。色谱柱为DiscoveryC18柱(5μm,4 6mmi.d.×250mm);流动相为1.7mmol/L氯化锂 甲酸 甲醇(体积比为65∶1∶34)混合溶液,流速为1 0mL/min;柱温为40 0℃;电化学检测器工作电位为1 25V。猪组织中克伦特罗含量为0 5～500ng/g时,克伦特罗的含量与其峰面积之间存在良好的线性关系(r>0 99),在组织中按0 5,50,500ng/g3个添加水平做克伦特罗的回收率试验,其回收率为75 8%～87 1%(n=4)。该方法重现性好,灵敏度高,简便,可用于猪的肌肉、肺脏、肝脏、肾脏及脂肪组织中克伦特罗残留的检测。

环丙沙星对土壤微生物量碳和土壤微生物群落碳代谢多样性的影响

采用氯仿熏蒸浸提法和Biolog法,分析环丙沙星作用下的土壤微生物量碳和微生物群落碳代谢多样性,以揭示环丙沙星在环境中残留对土壤微生物学性状的影响。结果表明,环丙沙星(wCIP≥0.1μg/g)对土壤微生物量碳含量影响显著(P<0.05),土壤中环丙沙星浓度愈高,微生物量碳含量愈低,100μg/g的环丙沙星处理使土壤微生物量碳含量下降58.69%。环丙沙星对土壤微生物群落碳代谢功能影响显著,环丙沙星降低了土壤微生物对碳水化合物、羧酸、氨基酸、聚合物、酚类和胺类的碳源利用率;环丙沙星(wCIP≥0.1μg/g)显著影响了土壤微生物群落碳源代谢强度和代谢多样性,但不同浓度的环丙沙星对土壤微生物群落碳代谢功能的影响不同,0.1、1、10μg/g的环丙沙星处理对土壤微生物群落碳代谢功能的影响主要表现在处理前期(用药第7天、21天),这种影响在处理后期(用药第35天)表现不明显,100μg/g的环丙沙星在用药的前期和后期均显著影响土壤微生物群落碳代谢功能,土壤中环丙沙星积累到该浓度可能对土壤微生物群落碳代谢功能产生难以逆转的长期影响。

恩诺沙星对土壤微生物群落功能多样性的影响

为了评价恩诺沙星(enrofloxacin)对土壤微生物群落的影响,借助BIOLOG检测法比较了不同浓度恩诺沙星影响下的土壤微生物的群落特征。结果表明,各添加药物组与空白对照组的土壤微生物群落代谢多样性差异显著(P<0.05),空白对照组土壤微生物在BIOLOG微平板上的平均每孔颜色变化率(AWCD)和微生物代谢多样性指数(丰富度和多样性)显著高于添加药物组;药物显著影响微生物群落对BIOLOG微平板中碳源的利用能力,较低浓度的恩诺沙星(0.01μg/g)就显著影响了土壤微生物群落对α-Ketobutyric Acid、L-Phenylalanine、1-Erythritol、D-Xylose等碳源的利用代谢能力(P<0.05),且土壤微生物群落利用各类碳源的能力随药物浓度加大而降低。由此可见,恩诺沙星在土壤中残留时对土壤微生物的影响不容忽视。