杏鲍菇麦角硫因生物合成基因挖掘及在酵母中的组合表达

【目的】麦角硫因(EGT)是一种组氨酸衍生而来的天然氨基酸,具有抗氧化、抗炎症、抗癌以及预防神经系统类疾病等多种生理功能。从杏鲍菇中挖掘出EGT合成酶基因并在酵母中进行表达及功能鉴定,阐明杏鲍菇EGT的合成途径,为高效合成EGT提供基因资源及培育高产EGT的杏鲍菇新品种提供依据。【方法】运用生物信息学方法从杏鲍菇基因组中克隆了4个EGT合成酶基因PeEgt1、PeEgt2-1、PeEgt2-2、PeEgt2-3,并以酿酒酵母IMX581菌株为表达宿主对该基因进行异源表达,采用高效液相色谱法测定EGT产量,鉴定基因功能。【结果】分别构建了单基因、双基因和三基因的酿酒酵母IMX581工程菌株。整合了PeEgt1的单基因酿酒酵母工程菌株可合成EGT;与单基因工程菌株相比,整合了PeEgt1、PeEgt2-1或PeEgt1、PeEgt2-2的双基因酿酒酵母工程菌株的EGT产量均有显著提高,而整合了PeEgt1、PeEgt2-3的双基因酿酒酵母工程菌株的EGT产量没有提高。表明PeEgt1、PeEgt2-1、PeEgt2-2基因有功能,表达的酶有活性,而PeEgt2-3基因没有功能。整合了3个基因的PeEgt1-PeEgt2-1-PeEgt2-2酿酒酵母工程菌株的EGT产量较双基因工程菌株没有显著提高,推测可能是PeEgt1合成的组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜底物不足以提供PeEgt2-1、PeEgt2-2两个酶的反应,限制了酿酒酵母EGT的进一步合成。【结论】在杏鲍菇中克隆的EGT合成酶基因PeEgt1、PeEgt2-1、PeEgt2-2有功能,表达的酶有活性,且PeEgt2-1、PeEgt2-2可能是同工酶;杏鲍菇EGT的生物合成途径由PeEgt1、PeEgt2两个基因组成。

基于CRISPR／Cas9系统的金针菇基因组编辑载体构建

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9,构建金针菇基因Mads-8敲除载体及转化体系。以转录组数据为依据,通过分析基因Mads-8序列信息,选择高效的靶位点序列,同时加入筛选标记基因hph构建过渡载体sgRNA-T,通过菌落PCR鉴定和测序来验证靶位点序列是否正确插入。以表达载体pg Fvs-cas9为框架,酶切连接后构建重组敲除载体pg Fvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鉴定敲除载体。再以PEG介导的金针菇原生质体转化表达载体,在潮霉素抗性平板上筛选拟转化子,以拟转化子基因组DNA为模板扩增Cas9基因。结果显示,靶位点序列成功插入敲除载体且序列正确,重组质粒成功转化进金针菇的基因组。对金针菇基因组敲除载体的构建,为后续金针菇相关基因的功能验证及育种研究提供载体材料及理论依据。

金针菇耐高温新菌株的诱变选育

以黄色金针菇(Flammulina velutipes)菌株FV7为材料,采用紫外线诱变、氯化锂诱变和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变等多种诱变方法对金针菇的菌丝细胞进行诱变,诱变后的菌丝细胞经过菌丝体生长阶段33℃高温初筛和子实体发育阶段20℃中温复筛,并经过多轮筛选获得耐高温突变菌株FV7EMS。研究结果表明,采用甲基磺酸乙酯对金针菇菌丝细胞的诱变效果明显,突变菌株FV7EMS能在20℃温度出菇,且生长速度快、菌柄较长,生物学效率比亲本FV7提高了28.82%,与亲本间存在较大的遗传差异。金针菇耐高温新品种的培育,对于降低工厂化栽培能耗、多季节栽培金针菇有重要的科学研究价值。

酿酒酵母工程菌生物合成白藜芦醇

目的:构建能以酪氨酸为底物产白藜芦醇的重组酿酒酵母。方法:利用降落-重叠延伸PCR法和一步等温法,将拟南芥的4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4cl)、巨峰葡萄的白藜芦醇合酶基因(rs)以及粘红酵母的酪氨酸解氨酶基因(tal)分别构建含有不同抗性筛选标记的附加型酵母表达载体,采用Li Ac/SS carrier DNA/PEG法转化酿酒酵母工业型菌株EC1118,通过高效液相色谱法检测重组酵母发酵产物。结果:成功获得酵母工程菌EC1118-H-TTC-K-T4C-TRC,以3 mmol/L酪氨酸为底物,28℃,150 r/min摇床避光发酵5 d,发酵液中白藜芦醇的产量为6.1979 mg/L。结论:成功构建一株能以酪氨酸为底物产白藜芦醇的工业型重组酿酒酵母,为白藜芦醇的工业化生产进一步奠定了基础。