细胞因子诱导杀伤细胞联合白介素-2治疗头颈部肿瘤近期疗效观察

目的探讨细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)联合IL-2对头颈部肿瘤的治疗作用,观察近期的临床疗效、生活质量、免疫学反应及副作用。方法分离患者外周血单核细胞中的T淋巴细胞经体外诱导产生CIK细胞。所有患者接受CIK细胞过继细胞免疫治疗,1次/周,连续4次。结果随访时间6～18个月,中位随访时间12个月。15例患者中,1例甲状腺癌患者4个月后复查发现肿瘤进展;1例下咽癌放疗后肺转移患者CIK治疗6个月后复查发现肺部转移病灶进展。其余患者未发现局部复发及远处转移。与治疗前比较,患者的生活质量、免疫功能提高,无明显毒副作用。结论CIK细胞可延缓头颈部肿瘤进展时间,无明显毒副作用,提高患者的生活质量,可作为综合治疗方案的辅助治疗。

鼻咽癌中EB病毒启动子Qp的突变及其功能学研究

【目的】探讨鼻咽癌细胞中启动EB病毒核抗原1(EBNA1蛋白)表达的EB病毒Q启动子(Qp)的变异特征,比较有第62225位点(g→a)和第62422位点(g→c)两个点突变的Qp与原型Qp(B95.8型)的功能学差异及其生物学意义。【方法】采用PCR的方法扩增29例鼻咽癌组织石蜡标本和14例健康成人外周血标本(总共43例)中的Qp序列,PCR产物测序后分析其突变情况,统计学分析Qp中的点突变与鼻咽癌的相关性。把突变型和原型Qp分别克隆到荧光素酶报告基因载体上,检测相对光强度(RLU),比较突变型与原型Qp启动转录的活性。使用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验来比较突变型和原型Qp与Sp1蛋白的亲和力。【结果】通过PCR扩增和测序实验,证实Qp的突变与鼻咽癌有密切的相关性(P=0.0395,<0.05)。突变型Qp启动转录的活性明显高于原型(RLU之比约为2.5:1,P<0.05),并且突变型Qp与Sp1的亲和力较原型Qp增强约1.52倍。【结论】在鼻咽癌组织中,突变型Qp可能通过增强与Sp1亲和力的机制,使其启动转录的活性明显增强。Qp特定位点的突变在EB病毒对鼻咽上皮细胞的感染和转化过程中可能起了重要的作用。

抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究

目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性.方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性.结果抗原免疫母鸡10 d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1：102 400,IgY抗体滴度在室温可保持5～6个月不变.结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好.

组织芯片制备及在肝癌研究中的应用体会

目的:探讨采用全自动组织芯片仪进行组织芯片制作,以及组织芯片在肝癌研究中的应用体会。方法:利用组织芯片仪制备肝癌组织芯片16枚,共包含313例肝癌患者肝癌组织。通过免疫组化方法检测了HLA-DR抗体,并比较其在肝癌癌旁及肿瘤内的表达情况。结果:采用全自动组织芯片仪能更加完好地构建肝癌组织芯片。用此组织芯片检测HLA-DR抗原在肝癌中高阳性表达率为51.1%,而在癌旁组织为76.4%,两者具有统计学差异(P<0.000 1)。结论:全自动组织芯片仪制备的组织芯片能简单、快捷检测相关蛋白在肝癌组织中的表达。组织芯片在肝癌研究中具有高效、快速、方便、经济等特点。

外源性TGF-β1调控鼻咽癌细胞株凋亡的实验研究

目的:应用体外实验研究探讨TGF-β1对鼻咽癌的作用机制。方法:应用免疫组化、MTT法和流式细胞仪技术,检测外源性TGF-β1对鼻咽癌细胞株生长、分化及凋亡等方面的影响。结果:TGF-β1受体TβRⅠ和TβRⅡ在鼻咽低分化CNE-2癌细胞株中均有表达,进一步给予梯度浓度的外源性TGF-β1作用于鼻咽癌CNE-2细胞株,应用MTT法发现外源性TGF-β1与对照组相比,能显著抑制CNE-2癌细胞株的生长,且最小显效浓度为0.1ng/mL,再用流式细胞仪进行检测,发现外源性TGF-β1作用后出现G1期阻滞、S期和G2/M期比例下降,凋亡比例则随着时间的延长逐渐增高且与对照组比较差异均有统计学意义。结论:TGF-β1/Smad信号传导通路可以通过调控鼻咽癌细胞的生长、细胞周期和凋亡等活动,从而参与鼻咽癌的发生和发展。

PPAR-γ抑制剂T0070907对人鼻咽癌细胞的生长抑制作用

【目的】探讨PPAR-γ选择性抑制剂T0070907影响鼻咽癌(NPC)细胞体外生长的作用机制。【方法】通过RT-PCR和Westernblotting检测PPAR-γ受体在5株NPC细胞株(CNE1、CNE2、HONE1、SUNE1和5-8F)中mRNA和蛋白水平的表达;MTT法检测T0070907对NPC细胞生长情况的影响;流式细胞术和Westernblotting检测T0070907对NPC细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白表达的影响。【结果】PPAR-γ在5株NPC细胞中均有表达;T0070907对NPC细胞株有明显生长抑制作用,并呈浓度、时间依赖性;T0070907作用于NPC细胞CNE1和CNE2后,G2/M期细胞比例则逐渐增加,且随着处理浓度的增加而增加,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,随着T0070907处理浓度的增加,NPC细胞的细胞周期相关蛋白CyclinA、CyclinB1、Cdc2、Cdk2蛋白的表达逐渐下降,无活性的pCdc2蛋白表达则逐渐增强。【结论】PPAR-γ抑制剂T0070907能够抑制NPC细胞PPAR-γ的蛋白表达,并通过对细胞周期相关蛋白CyclinA、CyclinB1、Cdc2、Cdk2、pCdc2等蛋白的调控导致细胞周期G2/M期阻滞,从而抑制NPC细胞的生长。

用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因

目的利用细胞的原代培养技术及人全基因表达谱芯片技术初步筛选出鼻咽癌差异表达基因,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因。方法分别用1例鼻咽癌细胞株C666及5例鼻咽癌培养出的原代细胞和3例鼻咽正常上皮的原代细胞,进行基因表达谱分析,并以荧光定量PCR及免疫组织化学验证芯片结果。结果原代培养的鼻咽癌细胞和鼻咽正常上皮细胞通过细胞角蛋白的免疫细胞化学染色、EBER1原位杂交和EBV-DNA荧光定量PCR证实;鼻咽癌原代细胞和鼻咽正常上皮原代细胞的基因表达谱有显著差异;4例以上共同表达的差异基因有493个,包括上调基因264个,下调基因229个。荧光定量PCR及免疫组织化学结果和芯片结果一致。结论用原代培养细胞及人类全基因组基因芯片构建基因表达谱能够准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的差异表达基因,该基因表达谱的建立为研究鼻咽癌分子生物学机制、鼻咽癌的分子分型和分子诊断提供了重要的分子依据。

吗啡对顺铂诱导的鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用的影响

【目的】以人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤为模型,探讨吗啡对顺铂抑制肿瘤生长作用的影响及其机制。【方法】建立CNE-2细胞裸鼠移植瘤模型20只,随机分为4组,对照组,单纯顺铂用药组、单纯吗啡用药组和吗啡联合顺铂用药组,每组5只。吗啡5mg/kg每天给药1次,顺铂3mg/kg每3d给药2次,均为腹腔注射。用药14d后处死动物,完整剥离肿瘤,记净瘤质量。TUNEL染色计算细胞凋亡数,免疫组化染色检测肿瘤组织Bax,Bcl-2,cleaved-caspase-3以及CD34的表达情况。【结果】单纯顺铂用药组的瘤质量明显小于其它3组(P<0.05),吗啡联合顺铂用药组的瘤质量明显小于对照组(P<0.05);TUNEL染色及cleaved-caspase-3染色显示单纯顺铂用药组的凋亡细胞数明显多于其他3组(P<0.05)。单纯顺铂用药组与其他3组相比Bax蛋白表达量增多,而Bcl-2表达量减少,单纯吗啡组的Bcl-2表达最强。CD34微血管染色显示单纯顺铂用药组的微血管密度显著少于其它3组(P<0.05),单纯吗啡用药组的微血管密度显著多于对照组(P<0.05)。【结论】吗啡通过拮抗顺铂诱导细胞凋亡及促进CNE-2细胞裸鼠移植瘤组织的血管生成,抵抗了顺铂抑制肿瘤生长的作用。

新基因hSSB1逆转录病毒载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

hSSB1(Human Single-strand DNA-binding protein)是参与细胞DNA损伤应答的一个重要信号分子。根据GenBank提供的hSSB1基因序列扩增其cDNA序列,插入到pBABE逆转录病毒载体中,连接后的质粒转化后经过双酶切,PCR扩增及测序来鉴定pBABE-hSSB1阳性克隆。将阳性表达的pBABE-hSSB1和包装质粒转染到HEK293T细胞中,产生病毒液。将包装好的病毒感染细胞并用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定表达hSSB1的细胞株。重组pBABE-hSSB1质粒经双酶切,PCR扩增鉴定及DNA测序分析等方法证实克隆成功。Western blotting检测发现转染重组质粒pBABE-hSSB1的细胞株中hSSB1蛋白的表达水平高于对照组。该研究成功构建了针对hSSB1基因的逆转录病毒载体(pBABE-hSSB1),并得到了稳定高表达hSSB1的细胞株,为深入研究其功能奠定了基础。

Manumycin与DDP、PYM、5-FU、ADR联合的体外抗舌癌作用

目的:探讨Manumycin(手霉素)与常用舌癌化疗药物顺铂、5-氟脲嘧啶、平阳霉素、阿霉素联合作用于舌鳞癌Tca8113的细胞毒作用。方法:细胞毒测定以MTT法;单药细胞毒测定以半倍浓度梯度设计;联合用药细胞毒测定以ChouTC中效原理设计。结果:Manumycin以及顺铂、5-氟脲嘧啶、平阳霉素、阿霉素单独应用对Tca8113均有明显的细胞毒作用。联合用药显示在相应比例剂量条件下,Manumycin与顺铂联合(3.75:1)后呈拮抗作用,Manumycin与5-氟脲嘧啶联合(0.75:1)作用后,低浓度联合相互拮抗,而高浓度联合时明显协同,Manumycin与平阳霉素(0.75:1)、阿霉素联合(30:1)作用后呈相互协同的作用(CI<1)。结论:Manumycin与平阳霉素、阿霉素以及与5-氟脲嘧啶高浓度联合作用于Tca8113细胞呈相互协同的细胞毒作用。

肝癌患者术前外周血甲胎蛋白mRNA检测与术后复发的关系

[目的]探讨肝细胞癌患者的外周血中甲胎蛋白(AFP)mRNA的检测在肝癌术后预后中的应用价值。[方法]应用巢式PCR和TaqMan MGB探针法定量PCR技术,检测105例肝细胞癌患者和30例健康志愿者外周血AFP mRNA的表达情况。[结果]肝细胞癌患者术前外周血AFP mRNA的阳性率43.8%(46/105)高于健康对照10.0%(3/30),有显著性差异(P< 0.001)。术前血中AFP mRNA的表达与各项肿瘤侵袭性指标显著相关,包括肿瘤数目、大小、有无肉眼及镜下血管侵犯。AFP mRNA阴性患者1、2、3年生存率以及1、2、3年无瘤生存率均显著比AFP mRNA阳性患者术后高(两者均P=0.004)。多因素分析也指出术前外周血中是否表达AFP mRNA是预测术后复发的独立因素。[结论]肝癌患者术前外周血中是否表达AFP mRNA与肿瘤侵袭性相关,对于预测术后复发具有重要价值。

靶向人Trb3基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定靶向果蝇同源蛋白3(tribbles-related protein 3,Trb3)基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,并检测其对靶基因的沉默效应。方法根据Genbank数据库中Trb3序列,设计、合成3对互补并特异性编码其shRNA序列的寡核苷酸,克隆到线性化的pSUPER.retro.puro质粒载体中,并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒和pSUPER.retro.puro Vector转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株,RT-PCR和Western-Blot检测其对靶基因Trb3的表达影响。结果酶切及测序鉴定重组质粒pSUPER.puro-shTrb3序列正确;转染重组质粒后舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中Trb3 mRNA和蛋白表达水平相对于空载体组明显下降,shRNA可以特异性沉默Trb3基因。结论成功构建了靶向人Trb3基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究Trb3在舌鳞状细胞癌和其他头颈肿瘤中的作用奠定了基础。

HLA-A2型人外周血MAGE-A10特异性T细胞的体外激发及功能检测

目的:探讨体外激发HLA-A2型人外周血单个核细胞(PBMC)中的MAG-E-A10(254-262)特异性T淋巴细胞及其功能检测方法。方法:分别采用肽段MAGE-A-10(254-262)直接刺激PBMC的Bulk Culture法和自体DC负载肽段MAGE-A10(254-262)刺激CD3+CD8+法,均经3次刺激进行体外扩增tetramer-MAGE-A10(254-262)阳性T细胞。以人流感病毒肽段flu-matrix(58-66)为阳性对照。Intracellular staining法检测其针对MAGE-A10(254-262)的穿孔素、颗粒酶B的分泌能力。结果:HLA-A2型PBMC用BuckCulture或DC负载肽段刺激CD3+CD8+法培养,激发的tetramer-flu阳性T细胞率均>10%,DC法激发的tetramer-flu阳性T细胞率显著高于Buck Culture,t=9.79,P<0.01。Bulk Culture法得到的阳性T细胞率分别为0.01%和0.02%,DC法则分别是0.05%和0.12%。Sorting得到的tetram-er-MAGE-A10(254-262)阳性T细胞,效靶比为10∶1时其特异性杀伤为46%,细胞针对MAGE-A10(254-262)分泌穿孔素、颗粒酶B的百分率分别为39%和87%。结论:从捐献的人血细胞中用自体DC负载肽段刺激CD3+CD8+法激发tetramer阳性T细胞的效率优于Bulk Culture法。

UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌危险性的关系

【目的】探讨UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌发病的相关关系。【方法】利用基因特异性引物扩增的方法鉴定不同人群UGT2B17基因的缺失多态性,研究对象包括鼻咽癌高发区广东地区的170例鼻咽癌患者(96例血标本和74例组织标本)和96例健康对照(血标本),鼻咽癌低发区河南及山西的各96例健康对照(血标本),观察UGT2B17基因的缺失多态性在中国鼻咽癌高发区和低发区人群之间的差异,并通过在鼻咽癌高发区广东进行的病例对照研究,运用二分类logistic回归分析研究UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌危险性的相关关系。【结果】①UGT2B17基因的纯合缺失型(del/del)在中国不同地区人群中的分布频率均较高(广东健康人群,67.5%;广东鼻咽癌患者,62.9%;河南健康人群,58.2%;山西健康人群,66.3%),且相互之间没有显著性差异(P>0.05),但其远远高于非洲和高加索人群(约10%)。②UGT2B17的各基因型和鼻咽癌之间的危险性分析结果显示UGT2B17基因的各基因型均不会增加鼻咽癌发病的危险性(del/ins:OR=1.693,95%CI=0.636～4.503;del/del:OR=1.132,95%CI=0.490～2.616;del/del+del/ins:OR=1.253,95%CI=0.551～2.847)。【结论】①UGT2B17基因的缺失多态性可能与种族密切相关,②UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌的发病未见显著关联。

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1启动子的突变

【目的】检测EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)远端启动子L1-TR在鼻咽癌(NPC)组织中的突变情况并探讨突变对启动子活性的影响。【方法】用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增出B95.8细胞和新鲜鼻咽癌组织细胞中EB病毒(EBV)的L1-TR片段,并测序比较其核苷酸序列的差异。构建含原型和突变型L1-TR启动子的荧光素酶报告质粒并分别转染HaCat细胞、B95.8细胞和C666-1细胞,比较两种启动子的活性。【结果】和B95.8原型比较,鼻咽癌组织中的EB病毒L1-TR启动子区域有多处缺失、插入和点突变,且启动子活性明显降低(P<0.05)。【结论】鼻咽癌组织中LMP1启动子L1-TR的活性与B95.8原型相比明显降低,这在EB病毒的免疫逃避机制中可能有一定的意义。

siRNAs干扰EBNA1下调EBV阳性鼻咽癌细胞内ALOX12的表达

【目的】利用RNA干扰技术抑制C666-1细胞中EB病毒核抗原1(EBNA1)的表达,探索氧化应激与抗氧化相关基因的表达变化。【方法】采用蛋白质印迹证实了能有效抑制EBNA1表达的干扰序列,使用甲基噻唑基四唑(MTT)方法检测C666-1细胞的存活率,利用实时定量PCR芯片技术探索了氧化应激与抗氧化相关基因的转录谱变化,并通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹进行了验证。【结果】EBNA1-1414和EBNA1-1437干扰序列转染C666-1细胞48h后,分别可抑制59%和56%的EBNA1蛋白表达,细胞存活率分别降低了33%和24%。PCR芯片实验发现干扰EBNA1表达后48hC666-1细胞中花生四烯酸盐12-脂氧合酶(ALOX12)蛋白表达有下调,谷胱甘肽还原酶(GSR)和过氧化物酶3(PRDX3)在转录水平表达上调。【结论】EBNA1或许能够通过上调ALOX12的表达间接地发挥促鼻咽癌作用。

基质金属蛋白酶1在结肠癌组织中的表达及其意义

目的探讨基质金属蛋白酶1（MM-1）在结肠癌中的表达及其结合临床分期对预后的指导意义。方法通过免疫组织化学法对1995年1月至2003年5月中山大学肿瘤防治中心手术治疗的620例结肠癌患者的组织芯片进行MMP-1表达检测，并结合临床数据进行分析。结果组织芯片有效结果为581例，MMP-1在结肠癌组织中的表达较在正常组织中高[72．5％（421／581）比30．8％（179／581），P=0．0001]。组织MMP-1在Ⅰ、Ⅱ期阳性表达率高于在Ⅲ、Ⅳ期[77．6％（235／303）比66．9％（186／278），P=0．0040]，在Ⅰ、Ⅱ期中表达时患者预后较差，在Ⅲ、Ⅳ期中表达时患者预后较好。COX多因素分析结果显示肿瘤MMP-1表达[危险比（HR）：1．042，95％可信区间（CI）：0．770—1．410，P=0．0001]，肿瘤大体（HR：0．966，95％CI：0．571—1．633，P=0．0150），局部浸润（HR：0．576，95％CI：0．413～0．805，P=0．0010）和肠壁浸润（HR：0．337，95％CI：0．197～0．575，P=0．0001）是结肠癌的预后因素。结论MMP-1是结肠癌的独立预后因素，组织MMP-1在结肠癌不同分期的表达意义不同，其表达结合临床分期对结肠癌的预后起一定的指导意义。

鼻咽癌患者放疗过程中血清VEGF水平的动态变化

为了观察鼻咽癌放疗过程中血清VEGF水平的动态变化,为放射治疗联合靶向VEGF治疗鼻咽癌提供理论依据,对33例鼻咽癌初治患者在治疗前、治疗期间及治疗后每周抽血检测血清中VEGF一次,采用ELISA酶连免疫吸附实验检测血清VEGF浓度。鼻咽癌患者放疗前、放疗中和放疗后的血清VEGF值分别为(308.63±203.04)、(483.36±245.11)和(381.41±249.95)ng/L。放疗前VEGF浓度与放疗中、放疗后浓度差异有统计学意义,P值分别为0.003、0.008,而放疗中与放疗后差异无统计学意义,P=0.209;放疗期间血清VEGF最高值以放疗第3～5周为主,占血清VEGF最高值周数的63.7%。初步研究结果提示,鼻咽癌患者放疗期间血清VEGF水平较治疗前明显升高,放射治疗联合靶向VEGF治疗鼻咽癌疗效显著,值得应用。

含钆纳米材料磁共振分子影像造影剂的研制

目的制备一种含钆纳米材料,应用于磁共振分子显像研究。方法以四甲氧基硅烷为氧化硅纳米材料来源,将钆离子掺杂至四甲氧基硅烷硅材料内,制备含钆纳米材料,电镜观察该材料纳米大小;MRI 体外扫描该材料,以 Gd-DTPA 为对照,检验该材料的磁敏感性;静脉注射该材料,应用 MRI 扫描,观察其在 Balb/c 裸鼠和鼻咽癌 CNE-2裸鼠移植瘤体内的分布特点。结果制备的含钆纳米材料呈短棒状,纳米大小约30至40 nm 左右,该纳米 T_1驰豫率明显高于常规造影剂 Gd-DTPA;裸鼠静脉注射后,30 min 后 MRI 扫描显示,肝脏和肾脏 T_1WI 信号强度分别由226±10和283±7升高为352±12及328±10,说明该材料主要在肝脏分布;鼻咽癌 CNE2裸鼠移植瘤明显强化,移植瘤T_1WI 信号强度由注射造影剂前的195±5上升为245±7。结论新型含钆纳米材料具有较高的磁敏感性,有望成为一种新型核磁共振分子显像的载体。