体内连续进化——从噬菌体到真核基因组的进化故事

进化是生物多样性产生和保留的自然进程。通过对编码蛋白质的基因进行有目的地设计和改造,获得性能更优异的蛋白质用于生产生活,是蛋白质工程的目的所在。为了在实验室中通过定向进化的蛋白质工程模拟自然进化的实现过程,研究人员通过在快速增殖的原核生物和简单的真核生物中引入靶向诱变元件,建立了各种体内连续进化系统。本综述介绍了体内连续进化平台的现状,重点关注噬菌体和酵母中人工进化技术的研究进展,并对其在生物技术领域中的成功应用进行了总结,最后简要展望了体内连续进化这一新兴领域的发展方向。

新鱼腥草素钠与顺铂共载药pH敏感脂质体的制备及其体内药动学考察

目的:制备新鱼腥草素钠(sodium new houttuyfonate,SNH)和顺铂(cisplatin,CDDP)共载药pH敏感脂质体,并考察其体内药动学性质。方法:使用薄膜分散法制备脂质体,单因素考察筛选最佳工艺处方,测定其包封率、共载药量、粒径、Zeta电位、pH敏感性和体外释放度。将SD大鼠随机分为2组,分别腹腔注射原料药溶液(SNH 16μg/g,CDDP 4μg/g)和同剂量的脂质体溶液,采用高效液相色谱法测定SNH和CDDP血药浓度,分析相关药代动力学参数。结果:最优处方工艺为载体组成1,2-二油酸甘油-3-磷脂酰乙醇胺、胆甾醇半琥珀酸酯、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的物质的量比3∶2∶0.15,药载比1∶5.43(m/m),油水比1∶1(v/v),水化温度37℃,超声功率60%,超声时间6 min。SNH和CDDP的平均包封率分别为(98.17±0.97)%和(50.43±1.12)%,共载药量为(12.28±0.54)%,平均粒径为(163.6±2.61)nm,Zeta电位为(-9.25±0.38)mV。SNH在pH值5.0和7.4环境中的累积释放率分别为67.54%和57.21%,CDDP在pH值5.0和7.4环境中的累积释放率分别为94.52%和79.68%。与原料药溶液相比,SNH与CDDP的药时曲线下面积(0-t)增大,半衰期延长,清除率降低。结论:SNH、CDDP共载药pH敏感脂质体有较好的pH敏感性,且可改善药动学性质。

基于果蝇口腔感染的肠道训练免疫模型研究

目的利用果蝇作为遗传工具从个体和分子层面研究果蝇的训练免疫效应,并为后续深入研究其分子机制提供依据。方法首先构建无菌果蝇模型,在此基础上构建果蝇成虫及跨发育阶段训练免疫模型,用两种革兰氏阴性菌——胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora carotovora 15)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分别经口腔感染果蝇。在第一次感染完全消退后进行再次感染,然后通过比较果蝇在两个感染阶段的存活率和细菌量来衡量训练免疫的潜在效果。通过实时荧光定量PCR检测相应先天免疫相关基因的表达水平,研究革兰氏阴性菌对免疫缺陷(IMD)通路的诱导作用。结果果蝇成虫及幼虫初次感染均可提高二次感染后的生存率、细菌清除效率及死亡时能承受的最高细菌负荷;二次感染的果蝇中,IMD通路中免疫反应基因的基础表达比未感染的高,这提供了获得感染抗性的分子基础;果蝇的免疫反应主要发生在中肠,二次免疫比初次免疫的效应更迅速且剧烈;二次免疫的果蝇中,肠道干细胞的数量显著多于初次感染。结论果蝇肠道中强大的训练免疫可由同源或异源革兰氏阴性菌口腔感染引发,且免疫记忆可在整个发育阶段持续存在;其可能作用于染色质,通过染色质修饰将免疫记忆储存在相关基因位点。免疫记忆跨发育阶段传递的一种潜在方式是通过肠道干细胞的JNK/STAT通路激活,这些干细胞可能在从幼虫到成虫的发育阶段携带免疫印记。

基于生物信息学分析铜死亡相关基因CDKN2A在肾上腺皮质癌中的作用机制

目的通过生物信息学分析铜死亡相关基因在肾上腺皮质癌(ACC)中的相关作用机制。方法联合肿瘤基因图谱(TCGA)以及GTEx数据库(肾上腺皮质癌:77例, 对照:128例)筛选出目标基因(CDKN2A)。通过临床相关性分析、生存分析、基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析从而探讨目标基因的相关功能以及在ACC中对预后的影响。通过免疫相关分析、药物敏感性分析研究目标基因与ACC中免疫细胞浸润以及药物敏感性之间的关系。通过卡方检验判断CDKN2A在不同临床因素分型中的表达差异性、通过R软件包的"survival"方法进行生存相关分析, 探讨CDKN2A的预后价值, 通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析探讨CDKN2A的相关功能。通过免疫相关分析、药物敏感性分析研究目标基因与ACC中免疫细胞浸润以及药物敏感性之间的关系。结果 CDKN2A在皮质癌中的表达量高于对照组(|log2FC|>2, P<0.05), CDKN2A的表达与ACC患者临床分级(χ^(2)=12.63, P<0.01)以及T分期(χ^(2)=14.17, P<0.01)相关。生存分析结果显示, CDKN2A表达量高的ACC患者预后较表达量低的患者差(风险比1.818, 95%可信区间:1.295~2.552, P<0.05)。富集分析的结果显示CDKN2A与肿瘤的发生发展相关。CDKN2A在ACC中与多种抗肿瘤药物的敏感性以及免疫检查点IDO1密切相关(cor=0.3, P<0.05), 且与ACC的肿瘤突变负荷呈正相关(R=0.49, P<0.01)。结论铜死亡相关基因CDKN2A与ACC预后、侵袭、免疫微环境以及药物敏感性密切相关。

遗传性耳聋分子诊断及梯级检测策略应用

遗传性耳聋是人类最常见的感觉障碍之一,具有高度遗传异质性。目前常用的遗传性耳聋分子诊断方法包括基因芯片、Sanger测序、靶向富集测序和全外显子组测序等,诊断率可达33.5%~56.67%,但还有相当一部分患者不能进行及时有效的分子病因诊断。考虑到患者家庭的经济负担及目前全外显子组/全基因组测序仍相对昂贵,根据患者情况提供包含多种检测手段的梯级诊断策略至关重要。因此,本文对遗传性耳聋分子诊断现状以及梯级检测在遗传性耳聋分子诊断中的应用进行综述,以期为诊断策略的选择提供参考。

成人肾上腺皮质癌预后影响因素研究进展

肾上腺皮质癌(ACC)是一种罕见且恶性程度较高的侵袭性肿瘤,预后极差。目前评估ACC患者预后主要依据肿瘤分期和肿物切除状态,但其逐渐不能满足临床对ACC总体疗效、患者病情进展程度的评估。而肾上腺皮质激素、血钾、血清白蛋白、年龄、性别、微RNA、着丝粒蛋白F基因、N 6-甲基腺嘌呤修饰相关基因、G 0/G 1开关基因2等因素均可影响ACC患者的预后。因此,深入了解影响成人ACC预后的影响因素不仅有助于临床医师准确判断患者状况,还可为探究ACC新的诊断标志物及靶向治疗的靶点提供新思路。

茯苓-泽泻药对配伍研究及其标准煎液对肾病模型大鼠的影响

目的:根据古代医典茯苓泽泻药对经方配伍规律开展肾病综合征药效筛选,为相关病症的中医临床方案和新药开发提供理论和实验参考。方法:查阅同时含有茯苓和泽泻的祛湿类经方信息,量化表达后分析“茯苓-泽泻”药对配伍规律。按《医疗机构中药煎药室管理规范》制备其经典比例标准煎液。将不同组别大鼠分别连续灌胃21 d后,采用代谢笼测定各组大鼠24 h尿量,采用酶标仪和全自动生化分析仪测定24 h尿蛋白(UP)、血清白蛋白(Alb)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)指标,采用苏木精-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理变化。结果:茯苓和泽泻在祛湿类经典方剂中配伍出现频次最高比例为1∶1,3∶5,2∶1;与模型对照组比较,给药3周后盐酸贝那普利组和不同配伍药对组24 h尿蛋白量均显著降低,血清Alb水平明显升高(P<0.01);不同药对组均有显著降TG作用,且以药对1∶1和3∶5组为最优;1∶1给药组较其他配伍组更显著降低SCr和BUN(P<0.05),并对肾组织病理损伤有一定的修复作用。结论:茯苓-泽泻药对配伍各给药组均能够显著减少多柔比星肾病大鼠24 h尿蛋白量,升高血清Alb水平,降低TC、TG水平,改善BUN、SCr,以茯苓-泽泻1∶1混煎为佳。

高氨诱导的肝细胞中凋亡相关LncRNA表达谱的变化

目的:探讨高氨诱导的肝细胞中凋亡相关长链非编码RNA(LncRNA)表达谱的变化。方法:将人正常肝细胞LO2细胞分为3组,对照组常规培养,高氨1组、高氨2组分别用10 mmol/L氯化铵溶液诱导24、48 h,以制备高氨肝细胞模型。应用人凋亡通路LncPathTM芯片筛选3组肝细胞差异表达的LncRNA和mRNA,并进行GO注释和KEGG通路分析,使用Cytoscope构建ceRNA网络图。结果:3组间差异表达的LncRNA有8个,差异表达的mRNA有13个。GO注释和KEGG通路分析结果显示,差异表达LncRNA及mRNA主要参与的信号通路有孕激素介导的卵母细胞成熟通路、神经营养因子信号通路、卵母细胞减数分裂和MAPK信号通路;ceRNA网络分析结果提示MAPK12是LncRNA BAIAP3的靶基因。结论:LncRNA BAIAP3可能通过靶向MAPK12在高氨致肝细胞凋亡过程中发挥重要作用。

校企合办本科专业集成化质量管理体系的建设

把在工作中学习的企业实践嵌入到大学生的培养方案对高等教育的质量提出了挑战。本文探讨如何把企业质量管理的方法应用到以学生为中心的校企合作人才培养过程,在全面质量管理和戴明环的基础上提出了一个重点旨在满足学生和社会需求、加强实践教学、全面管理校企合作办学的质量管理框架。该框架包含质量保障、质量控制和质量改进三个成分,遍布在整个培养过程的所有教学活动都依据PDCA模型有机地组织在一起,形成了一个集成化的质量管理框架。

新的基因复合杂合模式导致的综合征型耳聋家系研究

目的采用高通量测序技术,对一个综合征型耳聋家系的致病基因及突变进行探究。方法2018年6月至2020年7月,郑州大学第一附属医院耳科联合郑州大学相关机构对该家系进行了研究。该家系来自河南省濮阳市,2代4人,详细询问病史及家族史,绘制家系图。先证者及其妹患有先天性耳聋,其父母表型正常。对该家系进行临床表型分析,包括影像学、听力检查(包括纯音测听、声导抗、脑干诱发电位、耳声发射)、前庭功能检查及眼科检查(包括视力、视野、眼底检查、视觉诱发电位及视网膜电图)。靶向捕获129个耳聋相关基因的编码区域,采用高通量测序方法检测,并进行生物信息学分析,筛选疑似致病突变,使用Sanger测序和minigene试验进行验证。结果该家系共2代4人,其中第二代2人(即2例患儿)均患有双耳重度感音神经性聋,伴有双眼视力下降、夜盲症、周边视野敏感度下降及部分视野缺损,前庭功能正常。2例患儿均携带CDH23(NM022124.5)、c.6049G>A(p.Gly2017Ser)、c.9856C>G(p.His3286Asp)及c.8699A>G(p.Asp2900Gly),其中c.6049G>A及c.9856C>G遗传自表型正常的父亲,c.8699A>G遗传自表型正常的母亲。错义突变c.9856C>G及c.8699A>G在gnomAD数据库中未收录。错义突变c.6049G>A位于第46号外显子的最后一个碱基位置,生物信息学软件预测其可能影响剪切,minigene试验表明,该突变位点会造成第46号外显子的跳跃,导致其所表达的蛋白功能异常。通过文献检索,并根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传突变分类标准与指南,将c.6049G>A及c.8699A>G归类为致病/可能致病突变,c.9856C>G归类为临床意义未明突变。结论该病例是由CDH23剪切变异与错义变异复合杂合导致的Usher综合征1D型(USH1D),CDH23的这种复合杂合形式会导致USH1D。

国际基因工程机器大赛对本科生科研教育的启示

近年来,国际基因工程机器大赛(International genetically engineered machine,iGEM,简称iGEM大赛)在全球迅猛发展。仅2017年iGEM大赛全球注册队伍就达到了史无前例的313支,中国地区有98支iGEM团队报名参赛并取得了优异成绩。与国内已有的诸多大学生创新项目、科研培养项目不同,iGEM的组织模式是以学生为主体的研究型学习。该模式取得了丰富的教育效果,体现了新的教育理念,对于我国高校组织本科生课外科研训练有较大的借鉴意义。文中以北京大学参加iGEM大赛为线索,介绍国际基因工程机器大赛(iGEM)的背景和基本情况并以一个参赛周期为序再现北京大学iGEM团队组织和参赛的主要过程。通过与其他本科生科研训练的组织模式进行比较,探讨iGEM对本科生科研训练意义,并总结iGEM的组织经验和对本科生科研能力培养以及组织本科生科研学术竞赛的启示,希望能为国内高校的iGEM活动组织以及本科教育改革提供借鉴。

临床基因检测报告规范与基因检测行业共识探讨

二代测序技术（next generation sequencing，NGS）在临床的应用为广泛开展遗传病的基因检测、病因诊断、治疗及预防奠定了基础，但同时也伴随着一系列的问题，其中很重要的一个环节就是基因检测报告缺乏统一或基本的标准。首届“临床基因检测标准与规范专题研讨会”于2017年10月28日在深圳召开，来自全国138家机构的250多位遗传学专家、临床专家及第三方检测机构的代表共同探讨了遗传病基因检测报告的标准和规范问题。本文根据此次研讨会专家的意见和建议，就遗传病基因检测报告的原则、规范以及基因检测行业的发展进行了讨论，并发布了临床基因检测报告规范共识，以促进检测报告的规范化和标准化，推进我国基因检测行业的健康有序地发展。

学龄后儿童肾移植后BK多瘤病毒感染的影响因素及其预测模型构建

目的分析影响儿童肾移植术后BK多瘤病毒(BKPyV)感染的相关因素,并构建儿童肾移植术后BKPyV感染的预测模型。方法回顾性收集2014年1月至2022年3月在郑州大学第一附属医院接受同种异体肾移植的332例儿童受者的临床资料。依据BKPyV载量水平,分析不同时间点淋巴细胞的动态变化过程。应用Cox回归模型分析筛查BKPyV感染的相关因素,采用受试者工作特征曲线(ROC)评估预测感染模型的灵敏度和特异度。结果332例患儿中,男215例,女117例;移植年龄(12.2±3.9)岁;学龄前(1~5岁)37例,学龄后(6~18岁)295例。对224例患儿尿液与30例患儿血液样本的BKPyV载量检测结果显示,学龄前BKPyV尿症9例,BKPyV血症3例;学龄后BKPyV尿症76例,BKPyV血症14例。多因素Cox回归模型分析显示,较高体质指数(HR=1.105,95%CI:1.020~1.197)、抗人胸腺细胞免疫球蛋白应用(HR=2.196,95%CI:1.335~3.613)、较高他克莫司浓度(HR=2.484,95%CI:1.298~4.753)、较高自然杀伤(NK)细胞计数(HR=1.193,95%CI:1.009~1.411)、较高CD14^(++)CD16^(-)细胞计数(HR=1.096,95%CI:1.024~1.173)是学龄后儿童BKPyV尿症发生的危险因素;移植肾功能延迟恢复(HR=4.993,95%CI:1.555~16.038)、急性排斥反应(HR=6.021,95%CI:1.930~18.787)、较高CD14^(++)CD16^(-)细胞计数(HR=1.227,95%CI:1.081~1.392)是学龄后儿童BKPyV血症发生的危险因素。ROC曲线分析结果显示,联合体质指数、免疫诱导用药、他克莫司浓度、NK细胞计数、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数预测学龄后儿童肾移植术后0.5、1、2、5年BKPyV尿症发生的曲线下面积(AUC)分别为0.712(95%CI:0.626~0.798)、0.708(95%CI:0.612~0.804)、0.754(95%CI:0.668~0.840)和0.767(95%CI:0.685~0.849),预测模型的灵敏度和特异度分别为64.9%、61.4%、61.6%、55.8%和70.9%、72.4%、76.0%、84.0%。联合移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数预测学龄后儿童肾移植术后0.5、1、2、5年BKPyV血症发生的AUC分别为0.791(95%CI:0.631~0.951)、0.744(95%CI:0.547~0.936)、0.786(95%CI:0.629~0.946)和0.812(95%CI:0.672~0.948),预测模型的灵敏度和特异度分别为76.1%、67.1%、75.0%、77.9%和88.9%、89.0%、89.9%、88.0%。结论术后CD14^(++)CD16^(-)细胞水平可作为学龄后儿童肾移植后BKPyV感染的预测因子。联合体质指数、免疫诱导用药、他克莫司浓度、NK细胞计数、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数可预测学龄后儿童肾移植术后BKPyV尿症发生;联合移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数可预测学龄后儿童肾移植术后BKPyV血症发生。

基于生物信息学分析转移性嗜铬细胞瘤的机制

目的通过生物信息学分析鉴定转移性嗜铬细胞瘤的关键基因及分析相关的生物学通路,为临床诊断及治疗提供参考。方法从GEO数据库中下载51例样本(转移性嗜铬细胞瘤11例,对照组40例)的RNA表达谱数据,利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)分析识别与转移性嗜铬细胞瘤最为相关的模块。提取与转移性嗜铬细胞瘤密切相关的模块基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。接着,以基因显著性(GS)>0.4;成员之间相关性(MM)>0.6为阈值对模块基因进行初步筛选。为了防止过拟合,Lasso回归算法对初步鉴定的基因进一步筛选。最后采用受试者工作特征(ROC)曲线计算数据集的曲线下面积(AUC)值。结果通过对数据集进行WGCNA分析,共获得24个基因模块,其中浅蓝色基因模块与转移性嗜铬细胞瘤相关性最高(r=0.65),共包含218个基因。GO分析结果提示模块基因主要富集于细胞连接、细胞黏附分子等生物学功能;KEGG分析提示模块基因主要集中在"Wnt信号通路"等信号通路。对浅蓝色模块初步筛选,得到候选关键基因77个。通过Lasso回归算法进一步分析,鉴定出2个关键基因,即IRX3、KCNG3。ROC曲线结果提示IRX3、KCNG3在数据集中AUC值分别为0.897、0.878。结论利用生物信息学分析揭示与嗜铬细胞瘤转移相关的关键基因IRX3、KCNG3,为转移性嗜铬细胞瘤临床诊断和治疗提供基础。