去外泌体血清制备方法筛选及对成骨细胞与破骨细胞生物活性的影响

目的研究制备去外泌体血清的超速离心方法,并评估对成骨细胞与破骨细胞生物活性的影响,为研究成骨、破骨细胞来源外泌体相关研究提供理论参考。方法用NTA技术比较目前3种主流超速离心法以及商品化去外泌体血清的纳米颗粒去除效果,筛选最佳方法,并用Western blot验证。然后将最佳去外泌体血清作为Exo-free组,普通胎牛血清作为对照组分别培养原代成骨细胞与破骨细胞,利用ALP染色法、茜素红染色法观察成骨细胞成熟与矿化,EdU法检测成骨细胞增殖活性,流式细胞仪分析凋亡情况;应用TRAP评估破骨细胞诱导情况,并记录骨吸收陷窝数量分析骨吸收功能。结果NTA显示方法一(纯胎牛血清,100000×g,4℃,离心18 h)所得去外泌体血清效果最佳,纳米颗粒清除率达99.31%,优于商品化血清及其他两种方法,差异具有显著统计学意义(P<0.01);Western blot结果表明方法一所得血清中外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101表达均明显下降。Exo-free组成骨细胞ALP染色阳性面积、矿化结节面积和增殖活性均略低于对照组,而早期与晚期凋亡率略高于对照组,但上述差异均无显著统计学意义(P>0.05);Exo-free组与对照组骨髓单核细胞均在第5天呈现出明显融合迹象,且两组TRAP染色阳性面积及骨吸收陷窝数量不存在显著统计学差异(P>0.05)。结论方法一超速离心法(纯胎牛血清,100000×g,4℃,离心18 h)可高效去除血清外泌体,降低后续实验干扰,且去外泌体血清对成骨、破骨细胞生物活性无明显影响。