儿童急性下呼吸道感染病毒病原学分析

目的了解儿童急性下呼吸道感染病毒病原学特点。方法采用直接免疫荧光法(DIF),对2007年9月—2009年9月住院的5480例0～12岁下呼吸道感染患儿鼻咽分泌物进行8种病毒检测。结果5480例患儿中,2710例检出至少1种病毒,总检出率49.5%。呼吸道合胞病毒(RSV)检出最多,为1386例,占51.1%,其余,依次是偏肺病毒(hMPV)513例(18.9%),副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)338例(12.5%),腺病毒(ADV)192例(7.1%);流感病毒A(IFA)128例(4.7%),流感病毒B(IFB)79例(2.9%),副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)41例(1.5%),副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)33例(1.2%)。6个月以下年龄组阳性率最高,为43.5%。RSV、hMPV季节性较明显,主要集中在冬春季节(11月至次年4月)。肺炎、毛细支气管炎、支气管炎(伴喘息)、支气管炎(不伴喘息)和哮喘患儿病毒阳性率分别为47.4%、63.6%、50.5%、30.1%和43.5%。结论病毒是儿童急性下呼吸道感染的主要病原。发病年龄主要在婴幼儿,其中RSV和hMPV最常见。

807株流感嗜血杆菌的血清分型及耐药性的研究

目的了解南京地区儿童感染流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza,Hi)的血清型及抗生素的耐药性。方法采集南京儿童医院2004年6月至2007年6月20 985份不同种类标本,分离鉴定Hi 807例,玻片凝集法进行血清分型,纸片扩散法(K-B法)进行抗菌药物敏感实验,E-test法测最低抑菌浓度(MIC)。结果807株流感嗜血杆菌,血清分型,不定型(NTHi)47.71%,可分型中f型最多,占可分型36.02%,b型最少,仅占可分型1.66%。K-B法检测抗生素的耐药率,氨苄西林耐药率49.07%。结论南京地区儿童感染Hi,可分型株中主要血清型以f、a型占多数。氨苄西林的耐药率逐年上升。

儿童支气管肺炎患者病程各阶段细胞免疫和体液免疫的改变及临床意义

目的检测145例儿童支气管肺炎患者细胞免疫和体液免疫功能在病程各阶段中的改变,探讨其临床意义。方法采用流式细胞术对145例支气管肺炎患儿和50例健康儿童的外周血CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞进行检测。用免疫散射浊度法对145例支气管肺炎患儿和50例健康儿童的血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)进行检测。结果支气管肺炎患儿发病时外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞的相对计数和CD4+/CD8+比值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);血清IgG和IgA均比对照组降低(P<0.05)。接受3d对症治疗后患儿外周血CD3+、CD3+CD4+细胞的相对计数和CD4+/CD8+比值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);血清中IgG和IgA比对照组降低(P<0.05)。无临床症状,遵医嘱结束治疗后患儿外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞的相对计数和CD4+/CD8+比值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);血清中IgG、IgA和IgM与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论支气管肺炎患儿同时存在细胞免疫和体液免疫功能紊乱,免疫功能处于抑制状态,合理有效的治疗有助于恢复正常的免疫功能。对患儿免疫功能检测可帮助判断病情,指导治疗和评估预后。

有左侧耳聋等新表型的1例9号染色体部分三体患儿的分子核型研究

目的对1例有左侧耳聋等新表型的9号染色体部分三体患儿,进行分子核型研究,并讨论核型-表型的关系。方法对患儿进行染色体核型分析、多色荧光原位杂交和寡核苷酸微阵列比较基因组杂交分析,以确定患儿的核型和额外der(9)重复的拷贝数。结果G显带染色体核型分析发现核型为47,XX,+mar,经多色荧光原位杂交和多态性检测证实这个标记染色体源自9号染色体。寡核苷酸微阵列比较基因组杂交技术显示在9per→q21.11有69.5 Mb的重复,确定患儿核型为47,XX,+mar.ish der(9)(wcp 9+).arr cgh 9pterq21.11(DOCK8→LOC138225)×3。在该重复区有148个注释基因。结论该病例具有临床未报告过的新的表型。详细的分子核型和基因拷贝数重复的资料深化了对该病的了解,提供了可能的核型-表型关系和预后分析。

过敏性胃肠病患儿血维生素D水平与嗜酸性粒细胞及IgE相关性研究

目的 :探讨过敏性胃肠病患儿血清维生素D水平及其与嗜酸性粒细胞和Ig E之间的相关性。方法 :以25例健康儿童为对照,酶联免疫法测定41例过敏性胃肠病患儿血清25羟维生素D3[25(OH)D3]水平,用化学荧光法和免疫印迹法分别测定总Ig E和过敏原特异性Ig E(s Ig E)。结果:过敏性胃肠病患儿外周血25(OH)D3水平与对照组无差别(P>0.05),但维生素D不足[(25(OH)D3<75 nmol/L]的比率高(P<0.05)。虽然维生素D不足和维生素D水平正常[25(OH)D3≥75 nmol/L]的患儿外周血嗜酸性粒细胞计数在过敏食物回避前无显著差别(P>0.05),维生素D正常患儿嗜酸性粒细胞比率和绝对计数在过敏食物回避1周后显著下降(P<0.05),而维生素D不足患儿过敏食物回避后嗜酸性粒细胞比率和绝对计数与回避前比较,差异无统计学意义(P>0.05)。并且维生素D不足患儿血清总Ig E水平、总Ig E>180 U/L比率和s Ig E阳性率均高于维生素D正常组。结论:维生素D水平状态与过敏性胃肠病患儿嗜酸性粒细胞和Ig E升高有关。

儿童特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞亚群变化

目的:儿童分析特发性血小板减少性紫癜(ITP)外周血淋巴细胞亚群的变化。方法:应用流式细胞术,分别检测85例ITP患儿(ITP组)和32名健康体检儿童(对照组)淋巴细胞亚群。结果:与对照组相比,ITP组患儿外周血CD3+和CD4+细胞数量减少,CD4+/CD8+比值下降(P<0.01);CD8+细胞与对照组差异无意义(P>0.05)。CD19+细胞较对照组明显增多,CD16+CD56+细胞较对照组减少(P<0.01)。结论:ITP患儿淋巴细胞亚群与正常儿童存在差异,淋巴细胞亚群紊乱是儿童ITP发生的免疫机制之一。

CD34^+脐血造血干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的:建立稳定的CD34+脐血造血干细胞(CD34+UHSC)的体外分离、培养扩增体系,并研究其生物学特性。方法:密度梯度离心及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+UH-SC,加入细胞因子SCF、IL-3和IL-6进行体外培养扩增,观察细胞形态及其生长特性。应用流式细胞仪测定细胞周期及其CD34分子的表达,研究其增殖、生长和分化特性。以RT-PCR法检测干细胞高表达基因ABCG2的转录表达。结果:在体外培养条件下,CD34+UHSC悬浮生长,约1周后易形成克隆球,增殖旺盛,呈现指数生长期;细胞增殖周期随体外培养时间延长而逐渐趋缓;CD34+UHSC表面标志亦随体外培养时间延长而表达下降,同时ABCG2基因的表达亦逐步下调。结论:体外获得纯化的CD34+UHSC,生长稳定、增殖能力强,但随体外培养时间的延长,CD34+分子标志逐步丢失,提示在增殖旺盛的指数生长期7～21d内最适用于各项相关实验研究。

南京地区急性呼吸道感染儿童支原体、衣原体和常见呼吸道病毒病原学分析

目的了解南京地区急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)儿童除细菌外的其他病原微生物感染情况,指导临床诊断和治疗。方法应用荧光定量PCR法检测肺炎支原体(MP)和沙眼衣原体(CT),直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、甲型和乙型流感病毒(IVA和IVB)、副流感病毒1、2、3型(PIV-1、2、3)、人偏肺病毒(hMPV)。结果 1592例标本中,MP和CT阳性率分别为25.7%、2.4%;总呼吸道病毒阳性率为40.9%,其中RSV最常见,占阳性病毒株的61.3%,其次为PIV-3、hMPV,分别为6.7%、4.9%。病原体的混合感染率为6.7%,混合感染主要发生在1岁以内婴儿,有68例,占混合感染的63.6%。结论病毒感染是南京地区婴幼儿ARI的主要原因,RSV是首要病毒病原,MP也是常见的ARI病原体,1岁以内婴儿混合感染率高。

流感嗜血杆菌耐药基因及耐药机制分析

目的从分子水平了解南京地区儿童流感嗜血杆菌(Hi)对氨苄西林的耐药状况。方法对158株Hi临床分离株进行β-内酰胺酶检测,PCR扩增β-内酰胺酶的TEM及ROB编码基因,并克隆到T载体中作核酸序列测定与分析。结果本地区儿童感染Hi对氨苄西林的耐药率为41.77％。β-内酰胺酶阳性率为40．51％。TEM基因阳性89株,ROB阳性基因1株。63株耐氨苄西林且β-内酰胺酶阳性,耐药性主要是由于产生β-内酰胺酶和TEM基因。2株耐氨苄西林且β-内酰胺酶阴性。1株β-内酰胺酶阳性,但未检测到TEM或ROB基因。结论本地区儿童感染Hi对氨苄西林的耐药情况不容乐观,耐药机制主要是产生β-内酰胺酶,且以TEM型为主。

人血丙种球蛋白对川崎病血清诱导血管内皮细胞表达基质金属蛋白酶-9的影响

目的 观察川崎病患儿急性期血清对血管内皮细胞表达基质金属蛋白酶- 9(MMP- 9)的影响及人血丙种球蛋白对上述过程的调节作用。方法 血管内皮细胞 (ECV- 30 4 )培养分为单独培养组、正常血清组、川崎病血清组、川崎病血清 +人血丙种球蛋白组。应用明胶酶谱法、ELISA测定细胞培养上清中MMP 9活性和蛋白水平 ,RT- PCR法测定MMP 9mRNA表达。结果 川崎病血清组MMP- 9活性、蛋白浓度及mRNA表达水平均较单独培养组和正常血清组明显升高 (P <0 .0 1 ) ;而人血丙种球蛋白能显著抑制川崎病血清的上述诱导作用 (P <0 .0 1 )。结论 川崎病患儿急性期血清能诱导血管内皮细胞表达MMP -9增加 ,可能参与川崎病患儿冠状动脉损伤的发生 ;人血丙种球蛋白防治冠状动脉损伤机制 ,可能与抑制内皮细胞表达MMP- 9有关。

手足口病患儿外周血T淋巴细胞活化状态

目的研究手足口病患儿T淋巴细胞的活化状态及变化规律,探讨其临床意义。方法选择150例手足口病患儿为研究对象,按是否出现中枢神经系统并发症分为轻症组(115例)和重症组(35例);同时选择100例体检儿童为对照组。用流式细胞仪检测患儿和正常儿童的外周血HLA-DR^+CD4^+、HLA-DR^+CD8^+、CD38^+CD4^+和CD38^+CD8^+T淋巴细胞活化亚群的表达情况;用FQ-PCR检测轻症组和重症组患儿的血浆病毒载量。结果患儿CD4^+、CD8^+T细胞绝对计数低于对照组,其中CD4^+T细胞随病情进展进行性降低。患儿外周血HLA-DR^+CD4^+、HLA-DR^+CD8^+、CD38^+CD4^+和CD38^+CD8^+T淋巴细胞活化亚群均较对照组显著升高(P<0.01),其中HLA-DR^+CD4^+、CD38^+CD8^+T细胞升高最显著且随病情进展逐渐升高。重症组患儿血浆病毒载量显著高于轻症组(P<0.01),T细胞各活化亚群的表达量与病毒载量呈正相关,其中CD38^+CD8^+亚群表达与病毒载量相关系数最大,为0.618。结论肠道病毒感染所致手足口病患儿的T淋巴细胞发生异常免疫活化,活化程度与疾病进展相关。检测T淋巴细胞活化状态,能够判断患儿的免疫激活情况、病毒在体内的复制活跃程度,对于病情的诊疗和预后判断具有十分重要的临床价值。

流式细胞术检测血小板相关抗体在小儿特发性血小板减少性紫癜诊治中的价值

目的探讨流式细胞术检测血小板相关抗体在小儿特发性血小板减少性紫癜诊治中的价值。方法用流式细胞术测定53例ITP患儿及15例非ITP的血小板相关抗体(PAIgA、G、M)的水平,并分别进行ITP与非ITP的进行配对比较,ITP的PAIg与血小板计数行相关分析,ITP急性期与恢复期进行比较。结果ITP患儿的PAIgG,PAIgM和PAIgA分别为(77.00±20.99)%、(62.02±24.91)%和(48.98±25.36)%,明显高于非ITP的(28.47±32.52)%、(5.13±9.19)%和(10.27±17.09)%(P<0.01)。PAIgG、PAIgM和PAIg与血小板计数呈高度负相关,r值分别为-0.86、-0.79和-0.60,急性期PAIg高于恢复期(P<0.01)。结论血小板相关抗体可作为诊断ITP的重要参数,可与非ITP的患者进行鉴别,其数值(尤其PAIgG)与血小板计数呈高度负相关,并与预后密切相关。流式细胞术可快速、有效、准确地测定PAIg。

DNMT1和DNMT3B基因多态性与食管癌发病风险的关联分析

目的探讨DNMTl基因多态性位点（rsl6999593，rs2228611）和DNMT3B基因多态性位点（rs2424908）的基因型与食管癌及其病理参数的关联。方法采用病例对照研究，使用MassARRAY检测技术对258例食管癌患者和260例健康对照的3个多态性位点基因型分布进行分析。采用Logistic回归模型分析各基因型与食管癌发生的关系并比较不同基因型与食管癌病理参数的关系。结果DNMT1基因rs16999593位点TC基因型（OR=0．69，95％CI：0．47—1．00）和rs2228611位点GA基因型（OR=0．67，95％CI：0．46—0．98）与食管癌的低风险相关，rs16999593TC、CC基因型与食管癌分化程度相关（中分化：TCvs.TT：OR=0．53，95％CI：0．33—0．86；低分化：CCVS．1Tr：OR=2．79，95％CI：1．12—6．91），rs2228611GA基因型与高分化食管癌（GAVS．GG：OR=0．47，95％CI：0．25～0．88）和无周围淋巴结转移（GAVS．GG：OR=0．62，95％CI：0．39—0．98）有关，DNMT3B基因rs2424908CC基因型与肿瘤Ⅲ-Ⅳ分期（CCVS．Tr：OR=0．38，95％CI：0．15～0．92）及远端淋巴结转移（CCvs．TT：OR=0．18，95％CI：0．40—0．80）相关。结论本研究发现rs16999593和rs2228611位点与食管癌的发生及分化程度相关，rs2228611和rs2424908位点和淋巴结转移相关，rs2424908位点和肿瘤分期有相关性。

9号染色体部分三体患儿的表型与细胞、分子遗传学分析及文献复习

自1970年Rethoré等[1]首先用显带技术识别证实了9p三体核型,至今已报道的9p三体或9p部分三体综合征约150例左右,临床特征为生长和智力障碍,耳郭畸形,眼距过宽,眼球深陷，球状鼻，嘴角过低，手、脚趾发育异常等。本文报道1例9p部分三体患儿，并结合临床进行讨论。

CMV-DNA荧光定量PCR检测室内质控物的制备及初步应用

目的制备巨细胞病毒DNA(CMV-DNA)荧光定量PCR检测的室内质控物,并对其临床应用进行初步评价。方法收集一批CMV-DNA阳性尿液标本混合后作为室内质控物,前20次检测采用"即刻法"判断结果是否在质控范围内,20次后采用Levey-Jennings质控图,确定其靶值、标准差和变异系数,对室内质控结果进行判断。结果 107次试验中,前20次根据"即刻法",室内质控结果在控;20次后采用Levey-Jennings质控图,结果在控;60次检测结果的均值为5.41,标准差为0.33,变异系数为6.15%。结论利用混合尿液标本制备CMV-DNA室内质控物,制备方便,测定结果稳定,可以用作本实验室检测CMV-DNA的室内质控物。

荧光定量PCR法检测呼吸道感染患儿支原体、衣原体感染

目的:了解呼吸道感染患儿肺炎支原体、解脲脲原体、沙眼衣原体的感染情况。方法:应用荧光定量聚合链式反应法对571例呼吸道感染患儿同时进行肺炎支原体、解脲脲原体、沙眼衣原体检测。结果:肺炎支原体、解脲脲原体、沙眼衣原体总检出率为56.0％,其中肺炎支原体为29.1％,解脲脲原体为23.3％,沙眼衣原体为8.2％,肺炎支原体和解脲脲原体为3.2％,解脲脲原体和沙眼衣原体为1.4％。在年龄分布上,<28 d组患儿解脲脲原体感染率高达30.3％,且与其他组的差异有显著性,1个月-1岁组、>1-3岁组和>3岁组的患儿肺炎支原体感染率明显高于<28 d组,差异有显著性。肺炎支原体感染率四季差异无显著性,解脲脲原体冬春感染率高,沙眼衣原体春季感染率低。血和痰两种类型标本,肺炎支原体与解脲脲原体阳性率之间差异有显著性,与沙眼衣原体阳性率之间差异无显著性。结论:新生儿较其他年龄段患儿易感解脲脲原体、沙眼衣原体;肺炎支原体随着年龄的增长感染率逐渐增高。痰标本的阳性率明显高于血液。荧光定量聚合链式反应法诊断支原体、衣原体感染快速、敏感,特异性高。

Down′s综合征存在倒置的小嵌合核型

目的观察正常细胞核型中含有极少量21-三体细胞的患儿临床表型及发育损害的相关关系。方法外周血淋巴细胞培养，常规染色体制片，G分带，计数30个细胞分裂相，有临床指征提示时加数至50-100个，计算正常细胞与21-三体细胞之间的比例。结果经过细胞核型与临床比对，发现正常细胞与21-三体细胞之间的比例在10-20：1时，患儿仍然具有Down综合征面容，诊断不困难。而如果这种比例在25-40：1时，患儿则可能完全不具备面容特征，但可出现生长发育落后，脑损害等（简称为倒置的21-三体小嵌合核型）。结论明确Down综合征存在倒置的小嵌合核型。对临床病因诊断，评估21-三体细胞携带者生育风险及其在Down流行病学上的作用都具有重要意义。

传染性单核细胞增多症患儿外周血象特点

目的:分析传染性单核细胞增多症患者外周血血象特点,探讨其在临床诊疗中的意义。方法:用五分类血液分析仪对43例传染性单核细胞增多症患者和20例健康儿童外周血进行分析,制作血涂片镜下观察异型淋巴细胞比例。结果:患者外周血白细胞总数显著增多,主要是淋巴细胞增多;容易发生贫血,但红细胞数与血红蛋白量常不一致,血红蛋白多低于参考值但红细胞多正常或仅轻微减低;血涂片中可见很高比例的异型淋巴细胞,以不规则型为主。结论:传染性单核细胞增多症患者外周血象有显著特点,有助于该病的临床诊疗,但也存在复杂多变性,需要注意鉴别诊断,以减少临床误诊漏诊。

核糖体蛋白S29与人肝癌细胞Bel-7402耐5-氟尿嘧啶的关系

目的探讨核糖体蛋白S29(RPS29)与人肝癌细胞Bel-7402耐5-氟尿嘧啶(5-FU)的关系。方法采用大剂量冲击法和逐渐增加剂量法构建人肝癌Bel-7402/5-FU耐药细胞系;用荧光定量PCR和Western blot检测RPS29基因和蛋白在敏感和耐药细胞中的表达;用siRNA干涉耐药细胞的RPS29,CCK-8法检测细胞存活率变化。用肝癌Hep G2/5-FU耐药细胞株验证阻断RPS29表达与5-FU耐药的关系。结果 Bel-7402/5-FU耐药细胞对5-FU的IC50为62μmol/L,耐药指数为22.7。RPS29基因和蛋白在耐药细胞中高表达,分别为敏感细胞的(2.21±0.19)倍和(1.79±0.28)倍(P<0.01)。干涉RPS29后,耐药细胞在一系列浓度梯度的5-FU作用下存活率分别比对照组下降(15.1±6.5)%、(24.3±4.2)%、(19.2±5.1)%、(16.3±6.8)%(P<0.05)。干涉RPS29表达后,肝癌Hep G2/5-FU耐药细胞株在一系列浓度梯度的5-FU作用下存活率分别比对照组下降(8.4±1.2)%、(13.0±2.3)%、(17.1±3.1)%和(12.2±1.5)%(P<0.05)。结论 RPS29基因和蛋白均在Bel-7402/5-FU耐药细胞高表达;低表达RPS29可提高Bel-7402/5-FU耐药细胞对5-FU的敏感性。低表达RPS29可提高Hep G2/5-FU耐药细胞对5-FU的敏感性。RPS29与肝癌细胞对5-FU的耐药性有关。

小鼠白细胞介素21原核表达载体的构建及活性鉴定

目的:白细胞介素21是近年发现的由T细胞分泌的细胞因子,具有广泛的免疫调节作用和抗肿瘤活性。为进一步观察其体内外免疫作用,拟构建小鼠白细胞介素21(mIL-21)原核表达载体,并对其表达的活性进行鉴定。方法:实验于2006-03/2007-05在南京医科大学附属南京儿童医院儿科研究所和东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系完成。实验材料:实验中所用BALB/c小鼠由扬州大学比较医学中心提供,六七周龄,雌雄兼备,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。pcDNA3.1/mIL-21质粒由东南大学基础医学院免疫学实验室提供、实验方法:以pcDNA3.1/mIL-21质粒为模板,PCR获得长度为369 bp的mIL-21基因片段。将其定向克隆至pET-28a(+)质粒中,采用PCR酶切和测序等方法对重组质粒进行鉴定。并对重组蛋白进行IPTG诱导表达、Western blot及体外生物学活性检测。结果:构建了重组原核表达载体pET-28a(+)/mIL-21,经鉴定后证实重组质粒构建正确。SDS-PAGE显示含重组质粒的诱导菌在M16 000位置出现一蛋白条带。Western blot结果显示该蛋白具有良好的免疫原性。体外生物学功能检测显示该重组蛋白能够增强小鼠脾细胞中的NK细胞杀伤活性。结论:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)/mIL-21,表达的mIL-21具有良好的免疫原性。