神经生长因子在不同条件下的活性研究

目的研究各种因素对神经生长因子(NGF)生物活性及免疫原性的影响。方法把天然NGF在不同浓度的变性剂、去污剂、氧化还原剂及其配伍中或在不同pH值、不同温度下进行孵育处理,测定其生物活性和免疫原性的变化。结果NGF在8mol/L尿素中孵育过夜后生物活性下降10倍,在浓度低于5mol/L的尿素中孵育过夜后生物活性基本不变;十二烷基硫酸钠和巯基乙醇对NGF生物活性破坏较大,且尿素可增加巯基乙醇的破坏作用;还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽配合使用对NGF生物活性的影响较小;NGF对温度敏感,在60℃孵育1h后活性降低约30倍,在37℃孵育48h生物活性开始下降;NGF在酸、碱中稳定。生物活性降低的NGF免疫原性未见明显改变。结论NGF的生物活性易受多种因素影响,但其免疫原性较稳定。

碱处理法在人神经生长因子注射液制备中的应用

目的进一步提高人神经生长因子(hNGF)注射液的安全性,寻找碱处理灭活制品中可能存在脂包膜和非脂包膜病毒的最佳工艺。方法在hNGF注射液中间品中加入脂包膜和非脂包膜病毒,通过调整其pH值、蛋白质浓度等参数后,在25℃下的不同时间,监测其灭活病毒效果。结果在pH(12.0±0.1)、(25±1)℃条件下存放2h,可有效灭活加入的脂包膜和非脂包膜病毒,且其他相关指标也达到要求。结论碱处理法是同时灭活生物制品中脂包膜和非脂包膜病毒的1种经济、有效的方法。

带有HIV Tat-蛋白转导域的人成熟神经生长因子的分泌表达及鉴定

HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)是一个公认的具有介导靶蛋白跨膜作用的肽段。为了表达出可溶的并具有生物学活性的PTD-NGF融合蛋白,作者首先根据人神经生长因子成熟肽(hNGFm)的基因序列设计引物,利用PCR技术直接从人胎盘的基因组DNA中扩增出hNGFm的编码序列,同时利用PCR引物在其5和3末端分别加上HIV-Tat-PTD及组氨酸标签(His-Tag)的序列,然后将PCR产物克隆于原核表达质粒pET22b中pelB leader的下游,构建分泌表达质粒pET22b-PTD-hNGFm-His,将该质粒转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测显示有两种表达产物,Mr分别为16ku和18.4ku,分别位于大肠杆菌周质腔和细胞质中,两者均可与抗hNGF抗体反应。周质腔表达产物(PTD-hNGFm-His)经Ni2+螯合亲和层析纯化后纯度达98%以上,纯化的PTD-hNGFm-His融合蛋白刺激神经突起生长的最适浓度为20ng/ml。因此成功构建了PTD-hNGFm-His分泌表达载体并在大肠杆菌中进行了分泌表达,得到了可溶且具有生物活性的PTD-hNGFm-His融合蛋白。