猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的克隆表达猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH),并测定其酶活性。方法设计引物采用PCR法自海安病人分离株Habb基因组扩增GDH的编码基因gdh,进行序列分析;构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测;通过亲和层析纯化,获得融合蛋白GST-GDH,用凝血酶剪切去除GST,获得完整的GDH纯化蛋白后测定其酶活性。结果PCR法自猪链球菌菌株Habb基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族I的典型保守序列;体外构建筛选原核表达质粒pGEX4T-2-gdh,诱导重组体,表达的蛋白经PAGE初步测定其相对分子质量(Mr)约为71×103;用凝血酶酶切去除融合蛋白中的GST标签后得到的蛋白相对分子质量为45×103;GDH活性测定显示猪链球菌GDH利用α-酮戊二酸做底物,用NADPH做辅酶催化氨的同化和谷氨酸的合成。结论克隆并表达出猪链球菌GDH;猪链球菌GDH属于GDH蛋白家族I,是NADP(H)-特异性GDH。

革螨、恙螨传播肾综合征出血热病毒的实验研究

目的 研究革螨、恙螨在肾综合征出血热病毒 (hemorrhagicfeverwithrenalsyndromevirus,HFRSV)传播中的媒介作用。方法 采集自然界鼠窝革螨及饲养繁殖的子代革螨和鼠体恙螨幼虫以及从小黑板采集游离恙螨幼虫及饲养孵化的若虫 ,进行螨细胞培养分别观察螨细胞传播HFRSV的作用。结果 发现螨细胞培养第 15d和第 2 0d可从螨细胞内检测到HFRSV ,其中HFRSV检出数和荧光强度在革螨子 4代、子 3代和恙螨若虫均多于和强于子 1代、子 2代及恙螨幼虫。结论 革螨、恙螨对HFRSV的传播有一定的媒介作用 ,在维持HFRSV的自然循环中起重要作用。

革螨及恙螨体内肾综合征出血热病毒定位的研究

目的 确定肾综合征出血热病毒 (HFRSV)在螨体内的定位。方法 用原位RT PCR技术检测HFRSV在螨体内的分布。结果 HFRSV多见于革螨及恙螨的卵巢卵细胞、中肠及中肠支囊上皮细胞的细胞核周围 ,呈弥散分布 ,前体组织细胞少见 ,其他组织细胞未见。革螨子 4代、子 3代和恙螨若虫阳性颗粒多于革螨子 2代、子 1代和恙螨幼虫。

用分子生物学方法检测螨体内汉坦病毒的研究

目的 研究汉坦病毒 (HV)在革螨、恙螨体内增殖、定位等。方法 采用聚合酶链反应和原位分子杂交法检测革螨、恙螨体内HV RNA。结果 用PCR技术从革螨、恙螨体内检测到HV RNA ,最低检测为 5只螨组 ;取革螨和恙螨幼虫、若虫定期测定TCID50 ml滴度 ,证明HV在革螨、恙螨体内可经期传播并有增殖现象 ;用原位分子杂交技术在革螨、恙螨的卵巢细胞、支肠细胞等组织中检测到HV RNA。结论 研究结果证明HV在螨体内可经期传播 ,并有增殖现象 ;HV通常定位于螨的卵巢和支肠细胞等组织内。为革螨、恙螨的媒介意义提供了具有分子水平的直接证据。

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

目的构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库。方法应用EB病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从EB病毒转化成功的B型个体淋巴细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增VH和Vκ基因,经重叠延伸拼接法(SOE)组成ScFv基因并将其克隆入pCANTAB5E,转化E.coliTG1,加入辅助噬菌体M13KO7援救,构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv基因的插入率。使用完整A型红细胞对该库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,细胞ELISA、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定。结果所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010PFU/mL的初级噬菌体抗体库。以完整A型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集。经细胞ELISA、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A型红细胞特异结合的ScFv噬菌体抗体。结论EB病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A抗原的基因工程抗体。

华东地区三种类型恙虫病自然疫源地调查

目的 为查明恙虫病的自然疫源地类型给预防工作提供依据,在福建、浙江、江苏三省进行了系列调查。方法 ①在三省选择有代表性的调查点;②收集地理景观及疫情资料;③现场调查及实验研究:主要是鼠类、恙螨与疾病的关系。结果 研究证明恙虫病在三省存在具有代表性的三型自然疫源地:①沿海岛屿型疫源地主要分布于福建。主要储存宿主为黄毛鼠;主要媒介恙螨为地里纤恙螨;流行季节在夏季;恙虫病立克次体(Rt)分型:Gilliam型。②内陆山林型疫源地分布于浙江。主要储存宿主为社鼠;主要媒介恙螨为高湖纤恙螨;流行季节在夏季;Rt分型:Gilliam型。③内陆平原丘陵型疫源地分布于江苏。主要储存宿主为黑线姬鼠、褐家鼠、社鼠、大麝;主要媒介恙螨为小盾纤恙螨;流行季节在秋冬季;Rt分型:Kawasaki型。结论 福建、浙江、江苏三省恙虫病的病原体型别、储存宿主、媒介恙螨与流行特征均有所不同。