基于免疫金银染色的蛋白质与抗原分子微阵列技术

目的 研制适于自身抗体检测的蛋白质与抗原分子微阵列。方法 利用氧化型琼脂糖凝胶膜结合戊二醛分子衍生的活性表面 ,制作蛋白质与抗原分子微阵列 ,建立了检测血清自身抗体的胶体金免疫金银染色方法 (IGSS)。结果 在未经选择的风湿病患者中 (包括SLE ,RA和MCTD) ,检出多种自身抗体阳性 ,其中又以子宫内膜抗体 (EmAb)、抗ssDNA抗体、抗TG抗体、抗TPO抗体和RF等的检出频率较高 ;但心磷脂抗体 (ACA)、抗LSP和抗精子抗体 (AsAb)均为阴性。经初步方法学对比考证 ,实验结果与ELISA有较好的一致性 (达 90 % )。结论 本法具有方法敏感 ,结果直观和实验条件易于控制等特点 ,为发展可视化阵列芯片提供了一种很好的模式。

氧化型琼脂糖凝胶基片结合酶免疫反应的蛋白质分子微阵列

目的 研制适于常规免疫学检验的蛋白质分子微阵列。方法 利用分子组装技术 ,以琼脂糖凝胶为基质 ,于玻片表面制成自组装膜 ,经过碘酸钠氧化后再与戊二醛分子偶联 ,而成为具有双功能分子层的薄膜。基片表面衍生的醛基可与各类抗原 (如重组多肽、磷脂和DNA)、辣根过氧化物酶及抗体分子中的氨基形成Schiff′s碱共价连接。结果 基于上述原理 ,制作生物分子微阵列 ,优选出IgG分子的最佳点样浓度为 10 0 μg/ml,点样量以 5 0nl为宜。通过不同的实验模式 ,成功地在基片表面建立了酶免疫检测体系 ,可敏感特异地检出抗原、抗体分子及酶与底物之间的相互作用。结论 该法最突出的优点在于减少了样本和试剂用量 ,可对多种自身抗体实施高通量的平行分析 ,以酶 底物 (HRP DAB H2 O2 )作为芯片信号显示系统 ,结果较为直观 。

聚苯乙烯微孔板的表面修饰对酶免疫结果的影响

目的对聚苯乙烯板(PS)进行适当的修饰处理,以改善酶免疫分析的测定效果。方法以辣根过氧化物酶(HRP)为固相分子,用以观察酶与特异性底物之间的相互作用;用重组人增强肝脏再生因子(rhALR)、双链DNA(dsDNA)、心磷脂为包被抗原,以未氧化型与氧化型抗ALR为包被抗体,分别固定于不同修饰的PS板表面进行酶免疫分析,并与未经修饰处理的PS板作对比研究。结果生物分子的固定效果除与固相表面特征不同有关外,还与其本身的性质、所处的物理状态(包括分子的种类、结构、分子量大小和表面电荷等)密切相关。其中APTES与PLL修饰表面可显著改善rhALR、dsDNA、心磷脂抗原及氧化型抗体分子的固相化效果,提高酶免疫分析的吸光度值和测定敏感度。UV辐照PS板用于抗ALR和抗dsDNA抗体,醛基化表面(GA修饰)用于抗心磷脂抗体的测定亦可获得较高的特异信号显示与低背景噪音。AFM表征结果显示:疏水物理吸附的生物分子分布是随机和不规则的,且为聚集成团分布;而电荷引力与共价结合模式固定的生物分子空间取向与分布较为均一,可提高固定生物分子的数量和功能化保留程度。结论PS板经修饰处理后可改善对免疫分子的吸附能力,基于共价键和电荷引力结合模式可获得较为满意的酶免疫测试效果。

CyP A三类Ig自身抗体测定方法的建立与临床应用

利用基因重组技术，大肠杆菌表达人环胞菌素Ａ结合蛋白（ｒｈＣｙＰＡ），建立测定抗ＣｙＰＡ自身抗体的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），探讨抗ＣｙＰＡ抗体与临床疾病的关系。重组菌可溶性蛋白经饱和硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱层析，获取ｒｈＣｙＰＡ蛋白，用该纯化物作为抗原，方阵滴定，建立ＥＬＩＳＡ技术，对各类自身免疫病进行评估测定。ｒｈＣｙＰＡ经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析，分子量为１８ｋＤ。在系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者中，发现有４０．３％的病人检出有抗ＣｙＰＡ自身抗体（５８／１４４），三类Ｉｇ中，又以ＩｇＧ类抗体检出率最为突出，为２８％（４０／１４４）；而其他自身免疫病病人抗ＣｙＰＡ抗体总体检出率为０％～１８．１％。

两种不同示踪剂用于蛋白质与抗原分子微阵列信号检测的对比研究

以氧化型琼脂糖凝胶膜为基片 ,制作蛋白质与抗原分子微阵列 ,建立了检测固相人IgG、游离IgG和自身抗体分子的免疫学测定模式 ,分别以辣根过氧化物酶二氨基联苯胺双氧水 (HRP DAB H2 O2 )和胶体金硝酸银对苯二酚 2种示踪系统作为蛋白质与抗原分子微阵列信号显示剂 ,并对其作用的原理与特点进行讨论 .检测结果发现基于胶体金的免疫金银染色法 (IGSS)比固相酶免疫测定法(EIA)敏感 .2种示踪系统对固相人IgG的最低检出量分别为 0 .0 5ng和 0 .5ng;而对血清游离IgG的最低检出量IGSS法比EIA法至少高出 1 0倍 .两法用于自身抗体的测定亦表现出较好的重复性 ,在 1 4例HCV感染者中 ,自身抗体的总体检出率分别为 3 8.6%和 3 1 .4% ,结果具有显著的同步性 .故同时辅以 2种示踪剂并用于阵列芯片的联合测试 。

胶体金纳米粒子及其蛋白标记物在电场中的泳动行为研究

采用柠檬酸钠还原法制备了3种不同粒径的胶体金纳米粒子,分别用于与蛋白质分子标记。同时以琼脂糖凝胶为支持介质,观察其在电场条件下的泳动行为特征,并进行对比研究。结果表明,在特定电场条件下,胶体金纳米粒子愈小,其泳动速度愈快,但呈现弥散状分布特征。当胶体金颗粒包敷蛋白分子后即可得到很好的分离,且随标记的蛋白质分子不同而存在很大程度的差异,其在琼脂糖凝胶中的泳动速度依次为BSA,SPA,rhCaM和GAHIgG-γ球蛋白分子。该工作为研究特定生物结构分离、配体分子检测及微器件制作方面提供了新的思路。