GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及其对生长因子促细胞增殖效应的影响

目的:通过构建GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)对成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2,FGF2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-2,IGF2)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)促细胞增殖效应的影响。方法:应用基因重组技术及限制性内切酶酶切构建并鉴定pEGFP-N2-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,经脂质体LipofectamineTM2000介导转染SK-Hep-1后,通过G418(600μg/ml)筛选出抗性克隆,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GPC3mRNA在真核细胞中的表达,Western印迹法检测GPC3蛋白在真核细胞中的表达,并在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况,采用MTT法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2、TGF-β1、BMP4促细胞增殖效应的影响。结果:限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR及Western印迹法表明GPC3在真核细胞中成功表达,GPC3抑制了FGF2对SK-Hep-1细胞的增殖效应,而不抑制IGF2、TGF-β1、BMP4的促增殖作用。结论:编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用。

肠淋巴途径在大鼠重症急性胰腺炎致全身炎症反应中的作用

目的通过肠系膜淋巴管结扎（MLDL）阻断肠淋巴液回流，观察肠淋巴途径在大鼠重症急性胰腺炎（SAP）致全身炎症反应中的作用。方法将24只雄性SD大鼠按随机数字表法分为模型组、结扎组和假手术组，每组8只。采用胰胆管逆行注入牛黄胆酸钠溶液制备SAP合并多器官损伤模型；MLDL于制模前进行。术后24h测定血中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）、白细胞介素-6（IL-6）和内毒素水平及胰腺、肺脏、肝脏组织髓过氧化物酶（MP0）活性。处死大鼠取材，光镜下观察小肠组织形态学变化；培养肠系膜淋巴结细菌并计算细菌移位率。结果与假手术组比较，模型组血中DAO、D-乳酸、TNF—α、IL-6和内毒素水平均显著升高[DAO：（0．64士0．17）kU／L比（0．37±0．07）kU／L，D-乳酸：（8．16±1．79）ng／L比（3．24±1．00）ng／L，TNF—α：（65．21±13．38）ng／L比（22．16±5．04）ng／L，IL-6：（7．95±1．83）ng／L比（4．26±1．23）ng／L，内毒素：（O．068±0．019）kEU／L比（0．033±0．009）kEU／L3，肠系膜淋巴结细菌移位率显著提高（75．0％比o），胰腺、肺脏、肝脏MPO活性显著升高[胰腺：（5．14±1．24）U／g比（2．88±0．75）U／g，肺脏：（9．07±2．52）U／g比（4．38±1．29）U／g，肝脏：（6．36±1．63）U／g比（3．19±0．96）U／g，均P〈0．01]；与模型组比较，结扎组血中DAO[（0．50±0．13）kU／L]、D-乳酸[（6．23±1．25）ng／L]、TNF-α（（48．50±13．23）ng／L]、IL-6[（6．06土1．64）ng／L3和内毒素[（0．048±0．014）kEU／L3均显著降低，肠系膜淋巴结细菌移位率（12．5％）显著减少，胰腺、肺脏、肝脏MPO活性[胰腺：（4．01±1．05）U／g，肺脏：（6．58±1．96）U／g，肝脏：（4．64±1．34）U／g3显著下降（P〈0．05或P〈0．01）。结论MLDL可以降低SAP大鼠肠道细菌和内毒素移位，减轻胰腺、肺脏、肝脏组织炎症损伤，保护肠屏障功能。