ImmuKnow^(TM)-Cylex检测技术在肾移植术后重症肺炎中的应用研究

目的探讨ImmuKnowTM-Cylex检测技术能否作为肾移植术后发生肺部感染的预警指标。方法收集17例肾移植受者的肝素钠抗凝全血46份,通过测量CD4+T细胞刺激后释放的ATP浓度来判定机体细胞免疫水平。结果肾移植术后重症肺炎发生前(移植术后两周内)组CD4+T细胞ATP值为(383.47±186.51)ng/mL,感染时组为(187.20±115.15)ng/mL,肺炎恢复后(恢复后1周内)为(427.79±177.44)ng/mL,显著低于重症肺炎发生前组,差别具有统计学意义(P<0.05);肺炎恢复后组与感染时组差别具有统计学意义(P<0.05)。结论 ImmuknowTM-Cylex细胞免疫能量测定适合于肾移植术后临床免疫状态的监测,对术后重症肺炎感染的发生有预警价值。

脐带血干细胞移植治疗糖尿病足1例

糖尿病足是糖尿病最严重的慢性并发症之一，也是糖尿病患者致残的重要原因。其发病机理之一为下肢大、小和微血管病变。研究显示外周血干细胞可以分化为血管内皮细胞，形成新生血管。2008年9月我院应用脐血干细胞移植治疗糖尿病足1例，疗效满意。

长期培养对基质细胞衍生因子1/CXCR4介导间充质干细胞迁移的影响

背景:人外源性的间充质干细胞能特异性地向损伤部位迁移,参与多种组织的损伤修复,然而其定向迁移的机制尚不清楚。目的:观察基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响。方法:体外培养不同个体的骨髓间充质干细胞,培养至第10代,检测细胞衰老状态。RT-PCR和细胞免疫荧光检测骨髓间充质干细胞CXCR4受体表达情况;体外迁移体系(Transwell)检测基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞迁移的影响。结果与结论:骨髓间充质干细胞在体外长期增殖后生长逐渐缓慢,在第6,7代衰老细胞增多,其CXCR4受体表达减少。基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞的趋化作用呈剂量依赖性。

凝血酶促进骨髓间充质干细胞增殖的作用与机制

本研究旨在探讨凝血酶促进人间充质干细胞(MSC)增殖及其机制。在无血清基础培养液中添加不同浓度凝血酶,用MTT实验检测人骨髓MSC增殖状态,PCR检测细胞蛋白酶活化受体(PAR)和c-MYC表达,Western blot分析信号通路的变化,并通过特异性抑制剂阻断凝血酶受体和信号通路,验证凝血酶作用的机制。结果显示,凝血酶可显著刺激MSC增殖,效应呈浓度依赖性;当凝血酶浓度为0.5 U/ml时,细胞增殖明显提高,浓度为8 U/ml时,刺激活性达峰值(P<0.01);PCR结果表明,MSC表达PAR-1和PAR2;当PAR1受体被阻断后凝血酶的促增殖效应被抑制,而PAR2受体被阻断后凝血酶对增殖结果影响不明显;凝血酶刺激MSC后,信号分子AKT发生磷酸化,c-MYC基因表达上调;当AKT信号通路被抑制后,c-MYC表达被抑制,凝血酶刺激细胞增殖效应被明显抑制。结论:凝血酶可通过PAR1受体介导的AKT信号通路的活化,上调MYC基因的表达,从而促进间充质干细胞的增殖。

新型化学转染试剂对人脐带间充质干细胞的转染优化

背景:人脐带间充质干细胞的基因修饰技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同。目的:对比3种新型化学转染试剂在人脐带间充质干细胞中的瞬时转染效率。方法:采用FugeneHD、LipofectamineLTX及Attractene分别转染人脐带间充质干细胞,荧光显微镜下观察阳性细胞,流式细胞术分析不同转染试剂的转染效率,锥虫蓝染色观察转染后人脐带间充质干细胞的生存率。结果与结论:LipofectamineLTX转染效率最高,显著高于FugeneHD和Attractene[(32.50±2.12)%,(4.30±0.64)%,(1.70±0.08)%,P<0.05]。LipofectamineLTX转染后的细胞生存率略低于FugeneHD及Attractene,但差异无显著性意义[(69.8±6.3)%,(92.4±4.2)%,(106.6±3.9)%,P>0.05]。提示LipofectamineLTX是人脐带间充质干细胞较为理想的化学转染试剂。

人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率

背景:人类胚胎干细胞的修饰和操作技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同。目的:对比观察两种化学转染试剂转染含不同启动子的增强型绿色荧光蛋白表达载体在人胚胎干细胞中的表达效率。方法:采用Fugene HD和lipofectamine2000分别转染无滋养层培养的H9细胞,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术分析不同载体pCAG-EGFP、pEGFP-N3在H9细胞中的表达效率。结果与结论:Fugene HD转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(42.45±3.32)%、(25.95±1.91)%,差异有显著性意义(P<0.05)。lipofectamine2000转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(1.94±0.18)%、(1.49±0.33)%。采用Fugene HD转染的表达效率均高于lipofectamine2000转染的表达效率(P<0.05)。结果显示在人胚胎干细胞的H9细胞系中,Fugene HD的转染效率显著高于lipofectamine2000;CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白表达效率显著高于CMV启动子。

间充质干细胞在恶性肿瘤生物学中作用的研究进展

过去近半个世纪的研究表明,间充质干细胞(MSCs)作为肿瘤微环境中细胞成份的重要成员之一,它在肿瘤细胞生长增殖、凋亡调控、侵袭性生长和转移、血管新生、能量代谢以及治疗抗性等诸多恶性生物学特性中均发挥重要的生物学作用,其相关的分子机制也逐步被揭示;相应地,基于这些发现的基因工程修饰和物理(化学)预处理的MSCs在特定肿瘤综合治疗中临床应用研究也取得了令人振奋的结果。本文就目前MSCs在恶性肿瘤发生发展中所起的生物学作用及其分子机制研究的相关进展作一综述,并就未来MSCs相关的新研究方向及其肿瘤综合治疗中可能的临床应用作一简单的展望。

诱导多潜能干细胞在疾病研究及治疗中的应用前景

1998年，Thomson等人从体外受精形成的囊胚中首次分离并建立了人类胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hES）系，由此推动了干细胞研究热潮的兴起。胚胎干细胞能够无限地自我更新，并且具有分化多能性，因而在临床应用中被寄予厚望。不过，利用胚胎干细胞治疗成功的病例却屈指可数，因为hES首先需要定向分化为特定组织的祖细胞，

脐带血干细胞移植治疗糖尿病足一例

糖尿病足是糖尿病最严重的慢性并发症之一,也是糖尿病患者致残的重要原因。其发病机理之一为下肢大、小和微血管病变。研究显示外周血干细胞可以分化为血管内皮细胞,形成新生血管[1]。2008年9月我院应用脐血干细胞移植治疗糖尿病足1例,疗效满意。患者女,67岁,1985年确诊糖尿病,口服降糖药治疗。2004年出现糖尿病视网膜病变,开始皮下注射胰岛素。2005年开始出现双下肢水肿,手足末端麻木,针刺样疼痛,

间充质干细胞治疗重症胰腺炎一例

急性重症胰腺炎是以胰腺弥漫性出血和组织坏死为特征，发病急骤，并发症和死亡率较高[1]。传统治疗手段包括抗炎和抑制胰腺外分泌及胰酶活性，属于对症治疗，尚不能有效促进胰腺组织修复和再生。研究表明，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）分泌多种细胞因子和生长因子，作用于周围组织发挥旁分泌作用，促进组织再生及防止纤维化形成。因此，MSCs可能成为治疗急性胰腺炎的新方法。

TNFα和TNFR1信号通路对小鼠急性肾损伤敏感性影响的研究

目的本研究拟从衣霉素诱导的内质网应激反应着手,观察肿瘤坏死因子α(TNFα)及TNF受体1、受体2(TNFR1、TNFR2)在急性肾组织损伤过程中的作用。方法采用衣霉素腹腔注射TNFα、TNFR1、TNFR2基因敲除小鼠及TNFR1R2联合基因敲除小鼠,造成其肾组织急性内质网应激反应和急性肾损伤,对各种小鼠肾组织分别进行病理染色、mRNA和蛋白水平表达检测、凋亡细胞染色、免疫组化染色和油红O染色等。在体外应用免疫印迹方法,检测TNFR1基因敲除小鼠肾近曲小管细胞的真核翻译起始因子2α(eIF2α)的磷酸化蛋白表达水平,并检测磷酸化酶抑制剂(salubrinal)作用后eIF2α的磷酸化水平。结果与C57小鼠相比,TNFα基因敲除小鼠对衣霉素引起的肾损伤更严重,且其病变主要位于肾近曲小管,表现为广泛的空泡变性、脂质聚积和细胞凋亡。提前24h用TNFα腹腔注射TNFα基因敲除小鼠,能逆转衣霉素引起的肾损伤。用衣霉素作用于TNFR1、TNFR2基因敲除小鼠,发现只有TNFR1基因敲除小鼠出现严重的肾损伤,而TNFR2基因敲除小鼠未出现类似的反应,提示TNFα主要通过TNFR1通路发挥作用。衣霉素诱导的急性内质网应激反应,未引起TNFα和TNFR1基因敲除小鼠肾组织中eIF2α的活化(磷酸化)。在体外,衣霉素也未引起TNFR1基因敲除小鼠肾近曲小管细胞的eIF2α磷酸化,反而造成小管细胞凋亡增加;eIF2α磷酸化酶抑制剂作用于TNFR1基因敲除小鼠肾小管细胞后,能明显提高eIF2α的磷酸化,降低小管细胞凋亡率。结论阻断TNFα/TNFR1信号通路能导致肾组织eIF2α失调,提高了对急性内质网应激损伤的敏感性。

再论免疫抑制剂的合理应用

外科技术的成熟,移植免疫学、免疫抑制剂和器官保存技术的发展,使器官移植由梦想变成了现实.半个多世纪以来,器官移植已成为救治器官功能衰竭最有效的措施,挽救了数以百万计患者的生命.

慢病毒载体系统介导hUC-MSC绿色荧光蛋白和荧光素酶共表达技术体系的建立

目的建立慢病毒载体系统介导的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶共表达技术体系。方法 GFP和荧光素酶共表达慢病毒载体与相应包装质粒psPAX2和pMD2.G经聚乙烯亚胺介导共转染HEK293T细胞以包装病毒;病毒感染P4代hUC-MSC 12 h后,再行嘌呤霉素筛选24 h,普通光学显微镜观察细胞形态,荧光显微镜下观察GFP的表达情况,IVIS Kinetic成像系统拍照以观察和记录慢病毒感染后hUC-MSC荧光素酶的表达情况;MTS法行细胞生长曲线作图,同时,普通和实时定量RTPCR法检测细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和p21WAF1/CIP1的表达。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果慢病毒感染并不会造成体外培养hUC-MSC形态的明显改变,而荧光显微镜和IVIS Kinetic成像系统的观察结果则分别证实,GFP和荧光素酶经慢病毒载体系统的介导可在hUC-MSC中成功地共表达。此外,细胞生长曲线作图结果表明,对照和GFP及荧光素酶共表达慢病毒感染后hUC-MSC的生长增殖速率相仿(P>0.01);实时定量RT-PCR法检测结果则显示,与对照慢病毒感染相比,GFP和荧光素酶共表达慢病毒感染后其细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和p21WAF1/CIP1mRNA表达水平分别是对照组的1.11倍(P=0.130)、0.54倍(P=0.000)和0.78倍(P=0.005),表明外源GFP和荧光素酶共表达对体外培养的hUC-MSC生长增殖等表型无显著影响。结论慢病毒载体系统可有效介导外源基因在hUC-MSC中的表达;同时,GFP和荧光素酶在hUC-MSC中的共表达也将极大地方便其体内转归的示踪。

间充质干细胞促进Luminal B型乳腺癌细胞生长增殖及其分子机制

目的分析人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对Luminal B型乳腺癌细胞生长增殖的影响,并初步探讨其可能的分子机理。方法绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶共表达慢病毒感染人Luminal B型乳腺癌细胞BT474,并经嘌呤霉素筛选两周后,于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,IVIS Kinetic成像系统拍照以观察和记录慢病毒感染后BT474细胞荧光素酶的表达情况;荧光显微镜下直接观察,结合MTS实验分析hUC-MSCs共培养或其浓缩上清处理对GFP和荧光素酶共表达BT474细胞生长增殖的影响;Western blot法检测hUC-MSCs浓缩上清处理对BT474细胞Akt和MAPK信号通路激活情况以及下游细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达的影响;常规RT-PCR法检测hUC-MSCs中NRG-1、NRG-2、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和EGF等配体的表达。荧光素酶表达强度与细胞数量的相关性经由Excel软件行统计学分析,MTS实验数据则经由SPSS13.0统计软件行统计学分析。结果荧光显微镜和IVIS Kinetic成像系统的观察结果分别证实,GFP和荧光素酶经慢病毒载体系统的介导可在BT474细胞中成功地共表达,且荧光素酶的表达强度与细胞数量呈直线相关。MSCs共培养或其浓缩上清处理均可显著促进Luminal B型乳腺癌细胞BT474的生长增殖,其细胞存活比例分别为各自对照组的148.06%(P<0.005)和147.99%(P<0.001);MSCs浓缩上清处理同时激活BT474细胞内Akt和MAPK信号通路,并上调细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达。此外,RT-PCR结果显示,hUC-MSCs中NRG-1和EGF的mRNAs水平呈高表达,而NRG-2、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ等配体的mRNAs表达也可见。结论 MSCs可通过表达并分泌NRG-1等配体,从而激活Luminal B型乳腺癌细胞BT474的下游Akt和MAPK信号转导通路以上调细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达,进而促进其生长增殖。