基于毕赤酵母系统表达的重组自身免疫调节生物制剂的研究进展

免疫调节制剂的靶目标为免疫系统相关分子如细胞因子、共刺激分子等,在治疗自身免疫病中很有潜力。免疫调节制剂的生产需要合适的表达系统,而毕赤酵母系统具有便于基因操作、易培养和高密度发酵等特征;更重要的是,毕赤酵母为真核细胞,可进行翻译后修饰并分泌可溶性的正确折叠的重组蛋白,其生物活性及功能也得到相应提高,这些优势使得毕赤酵母成为高效实用的蛋白表达宿主。我们就毕赤酵母系统表达的用于治疗自身免疫病的几种免疫调节制剂的研究进展做简要综述。

人自身抗原U1RNP 70K的酵母重组分泌表达及斑点免疫金渗滤检测法的建立

目的人自身抗原U1RNP 70K通常采用组织提取法或原核表达获得。文中用基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人U1RNP 70K自身抗原,并建立斑点免疫金渗滤检测法。方法 PCR扩增U1RNP 70K基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-U1RNP 70K。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western b lot)鉴定。用所表达的蛋白包被硝酸纤维素膜,建立检测U1RNP抗体的斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtrationassay,D IGFA)。结果 PCR产物约为1300 bp,接近于预期的1314 bp,pPIC9k-U1RNP 70K重组阳性克隆测序结果与Gen-Bank中的U1RNP 70K序列完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物U1RNP 70K的相对分子质量约70 000。W estern b lot证实表达产物具有天然U1RNP 70K分子的免疫原性,阴性对照菌无目的条带表达。D IGFA的检测结果与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为94.74%(54/57),阴性符合率为98.00%(49/50),总符合率为96.26%(103/107)。2种方法检测结果无统计学显著差异(P=0.617)。结论在毕赤酵母中成功地高分泌表达了U1RNP 70K蛋白,并建立了简便、快速、准确检测U1RNP抗体的DIGFA方法。

人SmD1抗原的酵母真核表达及其初步应用

通过PCR扩增Sm D1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SmD1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定。结果显示PCR产物约为360bp,符合预期,pPIC9k-SmD1重组阳性克隆双酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。表达产物SmD1的分子量约16kD,高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的。immunodot证实表达产物具有天然SmD1分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。Immunodot的敏感性为96%,特异性为100%,与免疫印迹法(immunoblot,IBT)的符合率为98%。SmD1在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础。

人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示,RT-PCR产物约为1 400 bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);两种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。

诱骗受体3—肿瘤基因治疗的新靶点

诱骗受体3(DcR3)又称肿瘤坏死因子受体(TNFR)6B,也有人称之为TR6,是新近发现的TNFR超家族成员之一。DcR3是一种凋亡抑制蛋白(IAP),能抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞免疫逃逸。近年来的研究显示,DcR3在人类正常分化组织中很少表达,却特异性表达于常见的肿瘤组织,它的表达上调可预示肿瘤恶性程度和预后。作为肿瘤分子标记物,体液及组织中DcR3高水平表达能作为肿瘤的辅助诊断和治疗监测。应用新近的分子生物技术可以抑制肿瘤细胞中DcR3的表达,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。

利用酵母重组SSB抗原建立快速斑点免疫金渗滤法检测抗SSB抗体

目的建立一种简便、快速、可靠的检测抗SSB抗体的方法。方法将毕赤酵母菌重组表达的SSB抗原包被于硝酸纤维素(NC)膜上,与待检血清中抗SSB抗体反应后,以胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(Staphy lococus protein A,SPA)作为显示剂,与截留的抗SSB抗体结合,出现肉眼可见的红色斑点。结果本法的敏感性和特异性分别为100%和98.75%,与欧蒙斑点酶免疫法检测结果之间的符合率为99.01%。结论本法快速、简便、准确,具有很好的临床诊断应用前景。

液态芯片技术在临床实验室诊断中的应用

液态芯片(liquid chip)是近年来新出现的一种临床应用型生物芯片,是以分类编码微球作为反应及信号检测载体,在液相反应体系中实现蛋白质、核酸等多种生物大分子的同步检测。既保持了生物芯片高通量的特性,又具有高灵敏度、高准确度、高精密度和线性测定范围宽及易操作等特点,在临床实验诊断领域具有广阔的应用前景。现就其基本原理、检测、特点在各临床诊断方面的应用作一综述。

骨肉瘤实验室诊断研究现状及对策

骨肉瘤起源于骨基本组织,是一种高度恶性预后不良的肿瘤,具有恶性程度高、侵袭性强、易复发和转移的特点,在我国发病率约为3/100万,是除多发性骨髓瘤以外最常见的骨原发恶性肿瘤,约占恶性骨肿瘤的44.6%,致残率及致死率极高,如不及时、系统地治疗,5年存活率仅有30%左右.该病好发于10~25岁青少年,男女之比约为2∶1,常见于四肢长骨骨端,特别是膝关节附近,主要临床表现为疼痛、肿胀、跛行(运动障碍),贫血及轻度发烧,病灶转移很快、很早,主要转移至肺部,再通过肺部转移至脑,但很少累及腹内器官及其他器官,许多患者因缺少骨肉瘤防治知识,加之临床早期又容易误诊为软组织挫伤或牵拉伤、风湿性关节炎、骨关节炎、骨髓炎、骨巨细胞瘤及软骨肉瘤等,常常贻误病情,一旦发现确诊,肿瘤已发展到晚期,往往已经完成肺转移,错过最佳手术时机.因此,骨肉瘤的早期诊断显得尤为重要.本文就骨肉瘤诊断方法研究现状及早期诊断对策综述如下.

可溶性CD30定量检测在恶性淋巴瘤诊断中的临床意义

在人淋巴系统增生性疾病中，CD30过度表达，其中霍奇金淋巴瘤（HL）中的Hodgkin Reed—Sternberg（HRS）细胞表达CD30具有重要意义，是其诊断和预后判定的特异性标志物。我们对2004年2月至2008年5月76例入住我院的HL和非霍奇金淋巴瘤（NHL）初发患者进行血清可溶性CD30（sCD30）定量检测，并与正常人进行比较，同时分组观察患者治疗前后、不同类型和不同临床分期及各疗效期表达水平的变化，进一步探讨其在恶性淋巴瘤中的诊断、分型及疗效判定的临床应用价值。