陆地棉早熟基因来源的遗传分析

棉花早熟性相关的性状多为复杂的数量性状,是由多个基因和环境共同作用的结果,其遗传基础研究比较困难。利用连锁作图和关联分析方法,对目标性状进行基因定位,找出与性状相关联的位点,为解析复杂性状的基因来源提供了新的手段。本文分别以早熟亲本新陆早8号和新陆早10号为母本,以陆地棉标准系TM-1为父本构建F2作图群体,利用在亲本间筛选出的多态性SSR引物,通过JoinMap 3.0软件构建了2张遗传图谱,以Win QTLCart 2.5复合区间作图法在F2~F2:3中定位到控制全生育期、苗期、蕾期、花铃期和霜前铃数等早熟性相关性状的37个QTL。控制早熟性的有利等位基因多数来自早熟祖先611波和金字棉。多数性状在两类材料中由不同的基因控制,且以加性遗传为主。在由43个陆地棉品种材料构成的自然群体中通过关联分析检测到54个与这些早熟性相关性状极显著关联的位点。研究表明连锁作图和关联分析的检测结果具有较高的可比性。本研究为早熟陆地棉聚合改良以及分子标记辅助育种打下了基础。

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol L–1 CaCl2和1.0 g L–1 BSA,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×106 mL–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40%PEG-4000介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。

用于区别不同棉花品种基因组特征的微卫星位点筛选

保守性强、重复性好、多态性高的微卫星位点可被有效用于构建作物DNA条形码。选取目前生产上主要推广种植、代表不同来源系统的12个棉花品种作为微卫星位点筛选材料,参考已构建的四倍体栽培棉种种间高密度遗传图谱信息,从376对覆盖全基因组的SSR引物中,筛选出51对引物可扩增出带型清晰且多态性高的微卫星位点。这些引物在12个供试品种中共产生155个等位位点,每对引物揭示的等位基因位点在2~7之间,平均值为3.04。参照微卫星位点的染色体定位和多态信息,在每条染色体上选择一个多态性相对高的SSR位点,其相应的26对SSR引物被推荐为构建棉花品种DNA条形码的一套首选引物,并初步应用于12个品种的DNA条形码编制。其余25对引物作为候选引物。使用该套引物扩增出的微卫星位点可用于大量棉花品种DNA条形码构建,为棉花品种真实性和纯度的分子鉴定奠定基础。

陆地棉背景下海岛棉第18染色体片段置换系的培育及相关农艺性状QTL定位

Sub18是以陆地棉遗传标准系TM-1为背景,含海岛棉3-79第18染色体的置换系材料。本研究以TM-1为受体亲本,置换系Sub18为供体亲本,借助分子标记辅助选择技术培育了一套以TM-1为背景,含海岛棉3-79第18染色体不同长度片段的置换系。这套置换系由45个株系构成,共78个置换片段。其中27个株系导入单片段,占总株系的60%;9个株系导入2个片段,占20%;9个株系导入3个及以上片段,占20%。导入片段总长度为467.6cM,约为该染色体遗传长度的4倍,每个株系内被替换的染色体片段长度不完全相同,平均遗传长度为5.99cM,最短的为0.9cM,最长的20.35cM。其中13个株系表现开放花蕾性状,涉及的最短导入片段长5.05cM。对TM-1、Sub18以及培育的45个导入系进行农艺性状调查和QTL联合定位分析,鉴定出纤维强度(qFS-C18-1)、整齐度(qFU-C18-1)、马克隆值(qFMi-C18-1)、成熟度(qFMa-C18-1)、皮棉重(qLW-C18-1)、籽指(qSI-C18-1)和衣分(qLP-C18-1)7个加性QTL和5个上位性效应QTL。研究结果为进一步精细定位目标QTL、克隆QTL以及重要性状分子设计育种奠定了基础。

RAD-seq技术在基因组研究中的现状及展望

Restriction-site associated DNA sequencing(RAD-seq)技术是在二代测序基础上发展起来的一项基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术。该方法技术流程简单,不受有无参考基因组的限制,可大大简化基因组的复杂性,减少实验费用,通过一次测序就可以获得数以万计的多态性标记。目前,RAD-seq技术已成功应用于超高密度遗传图谱的构建、重要性状的精细定位、辅助基因组序列组装、群体基因组学以及系统发生学等基因组研究热点领域。文章主要介绍了RAD-seq的技术原理、技术发展及其在基因组研究中的广泛应用。鉴于RAD-seq方法的独特性,该技术必将在复杂基因组研究领域具有广泛的应用前景。

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中,GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性,能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果,选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916),以该序列信息为探针,利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证,克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065bp,编码354个氨基酸,含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝,在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化,且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4(Chr.4)和D4(Chr.22)染色体上。定量RT-PCR结果表明,GhGDSL在开花后3～10d的纤维组织中表达量高,其中在海7124中表达高峰在8DPA,在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC1S1群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析,发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关,同时也参与纤维伸长过程。

一个棉花果糖-1,6-二磷酸酶基因的克隆与表达特征

棉纤维的正常发育需要大量的蔗糖供应。果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)是植物蔗糖合成途径中的关键酶,研究FBP将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机理,为纤维品质改良提供优异的基因资源。本研究以一个在陆地棉im纤维不成熟突变体和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank No.ES795598)为探针,通过电子克隆方法,结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证,获得一个棉花细胞质果糖-1,6-二磷酸酶GhFBP基因(GenBank No.KF305323)。该基因ORF全长1026 bp,编码341个氨基酸,含有12个外显子,11个内含子。GhFBP在二倍体棉种中含1个拷贝,在四倍体棉种中含2个拷贝,A、D两个亚组中各一个。利用SNP标记将GhFBP在异源四倍体中的一个拷贝定位于D2(Chr.14)染色体上。Q-PCR分析表明,该基因在纤维组织中优势表达,在其他组织中表达较低。GhFBP在开花后19 d的纤维组织中表达水平迅速增高。在次生壁发育早期的19、22 DPA纤维组织中,该基因在TM-1中的转录本显著高于im纤维不成熟突变体材料,推测GhFBP对纤维次生壁发育早期的纤维品质形成有重要作用。

一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析

棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一,对转化酶基因的结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制,并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤维突变体im和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank登录号为EY196825)为探针,通过电子克隆方法,结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证,克隆到一个棉花液泡转化酶基因GhVacInv2a(GenBank登录号为KF305322)。该基因ORF全长1857 bp,编码618个氨基酸,与已登录的陆地棉GhVacInv2基因(GenBank登录号为FJ864677)序列一致性为99%(E=0)。基因组序列分析表明,GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝,在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝,其中GhVacInv2a和GhVacInv2分属于A、D亚组同源基因。该同源基因含7个外显子,6个内含子。Q-PCR分析表明,该基因在花药中表达量最高,在快速伸长的纤维组织中优势表达。在13～19 DPA的纤维中,其在TM-1中的表达水平极显著地高于im突变体。开发SNP标记,将GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第3染色体上。标记与性状的关联分析显示,GhVacInv2a与纤维强度存在显著相关(P=0.0087),表明GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。

不同营养液浓度对温室黄瓜生长发育中氮分配规律的研究

氮在黄瓜生长发育中具有极其重要的作用。为了研究氮在温室黄瓜生长发育中的分配规律,本实验在智能温室中进行,以袋装珍珠岩为载体,采用霍格兰营养液进行施肥,即T1:1∶200;T2:1∶100;T3:1∶50;T4:1∶30。采用破坏性实验,测定黄瓜生长发育中各器官氮的含量。综合夏、秋两季的实验,可以得出T3处理对黄瓜生长发育中氮素的分配具有较好的促进作用。因此,研究结论可为温室黄瓜生长发育中氮的施用提供理论依据和决策支持。