灵芝三萜生物合成的研究进展

灵芝是具有广泛应用价值的食药用真菌,灵芝三萜是灵芝的主要药用成分之一,也是衡量其经济价值的重要指标。虽然灵芝三萜的主要合成途径已清晰,但是其分子调控机制并不清晰。基于近年来基因组学、蛋白质组学等的发展和遗传研究手段的进步,本文综述了灵芝三萜合成途径中的功能基因、信号分子(如活性氧、一氧化氮、钙离子等)和环境因子(如高温、营养、化学物质等)对灵芝三萜生物合成的重要作用,表明灵芝三萜的生物合成是由多种因素共同调控的,为高品质灵芝栽培提供技术创新的理论依据和技术指导,对提高我国食药真菌产品在国际市场的竞争力具有重要意义。

谷氨酸合酶在灵芝中生物学功能的研究

[目的]通过对谷氨酸合酶(glutamate synthase,GOGAT)的基因序列进行预测和分析,构建谷氨酸合酶基因的沉默转化子,验证谷氨酸合酶在灵芝吸收、利用氮源、生长及次级代谢中的作用。[方法]利用真菌中已报道的谷氨酸合酶基因,在灵芝基因组库中分析比对得到灵芝中可能的谷氨酸合酶基因。通过构建进化树和结构域分析及酶活性测定,确定灵芝谷氨酸合酶序列。随后利用RNA干扰技术,将灵芝的GOGAT基因进行沉默,研究GOGAT对灵芝生长及次级代谢的影响。[结果]获得灵芝谷氨酸合酶序列,该酶具有保守的谷氨酸合酶结构域,并且在进化上高度保守。在4种氮源(谷氨酰胺、铵盐、脯氨酸和硝酸盐)条件下检测谷氨酸合酶活性和基因转录水平,野生菌株中的GOGAT比酶活和转录水平在不同氮源条件下没有显著变化。通过RNA干扰方法,获得沉默效率分别为(77.0±1.9)%和(77.5±2.0)%的GOGAT沉默菌株2株。平板试验表明,将GOGAT沉默后,灵芝菌丝的生长受到一定程度的抑制。在硝酸盐培养条件下,相比于野生菌株,GOGAT沉默菌株基本停止生长;而在脯氨酸存在条件下,2株沉默菌株的生长直径分别降低(16.0±1.9)%和(21.0±1.3)%。进一步检测灵芝三萜含量发现,当使用铵盐或脯氨酸作为唯一氮源培养时,相比于对照菌株,GOGAT沉默菌株中的灵芝三萜含量分别降低(32.1±4.5)%和(11.0±1.1)%;而以谷氨酰胺和硝酸盐培养时,各菌株中的灵芝三萜含量没有显著变化。[结论]本研究获得了灵芝中合成谷氨酸的重要酶基因GOGAT,发现其对灵芝的生长及次级代谢十分重要。

灵芝钙调蛋白基因CaM的克隆与功能分析

灵芝是我国传统的食药用真菌,具有广泛的免疫调节功能并含有多种生物活性成分。灵芝酸是灵芝的主要次生代谢产物之一,具有较高商业价值。钙调蛋白(calmodulin,CaM)作为真核生物中重要的Ca^2+信使,能够参与生长发育、次生代谢等重要生理过程。本研究通过序列分析发现,灵芝CaM基因序列编码149个氨基酸,与其他物种CaM蛋白高度保守。该蛋白含有4个完整的EF-hand结构域,并且在每个EF-hand结构域中,都含有一个保守的D-x-D基序。进一步构建筛选了灵芝CaM沉默转化子,检测CaM在灵芝生长发育及次生代谢过程中的功能。结果显示,CaM沉默转化子中灵芝酸含量比WT降低约34%。沉默CaM后菌丝生长速率与WT相比降低40%。该结果说明CaM在灵芝生长及次生代谢过程中具有重要作用,为在真菌中研究CaM功能及调控途径提供参考。

灵芝转录因子AreA的生物学功能

AreA作为丝状真菌氮代谢中的关键转录因子,在真菌响应外界氮源、生长发育、次级代谢及抗逆过程中发挥了重要作用。本研究通过生物信息学比对分析,获得了灵芝AreA的全长序列,研究了AreA对菌丝生长、抵御细胞壁胁迫以及次级代谢的影响,AreA编码蛋白的C末端含有保守的GATA型锌指结构域,与其他担子菌中AreA的亲缘关系较近。通过qRT-PCR分析发现,外界氮源浓度的变化能够影响AreA的转录水平。在低氮源浓度条件下,AreA的转录水平显著高于氮源丰富的条件。利用前期构建的AreA沉默转化子研究发现,沉默AreA后菌株生长速率显著低于野生菌株,约下降70%;且AreA沉默菌株菌丝比野生菌株蓬松。细胞壁的组成成分检测发现,AreA沉默菌株的葡聚糖和几丁质含量比野生菌株(WT)和转入空载沉默质粒的菌株(CK)分别下降约65%和40%–60%。随后检测了对细胞壁胁迫的耐受性,结果发现AreA沉默转化子对刚果红和SDS极为敏感,几乎不能生长。在AreA沉默菌株中,灵芝三萜的含量相比于对照菌株下降了约23%。研究结果表明灵芝AreA能够响应环境中的氮源浓度,并且在灵芝的生长发育、次级代谢以及抵御细胞壁胁迫中发挥了重要作用。