小檗碱通过调节蛋白激酶B缓解对比剂肾病的作用及机制研究

目的探究小檗碱(berberine,BBR)对对比剂肾病(contrast-induced nephropathy,CIN)的作用及潜在机制。方法SD大鼠用于构建大鼠CIN模型,BBR治疗组(model+BBR,M+B)大鼠给予200 mg/kg BBR灌胃治疗,对照组(control,Con)大鼠和模型组(model,Mod)大鼠给予等量生理盐水灌胃。人肾皮质近曲小管上皮细胞(human kidney cortex proximal tubule epithelial cells,HK-2)用于构建CIN体外模型,Con组细胞不进行特殊处理,Mod组细胞使用50 g/L碘佛醇作用24 h,M+B组细胞使用50 g/L碘佛醇和30μmol/L BBR处理24 h。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)激动剂(SC79)和Akt抑制剂(MK2206)用于检测BBR对蛋白激酶B-叉头盒O3-核因子E2相关因子2(protein kinase B-forkhead box O3-nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Akt-Foxo3a-Nrf2)调控轴的调节作用。血肌酐(serum creatinine,Scr)检测和HE染色用于评估大鼠肾脏损伤情况。膜联蛋白V-碘化丙啶(annexin V-propidium iodide,Annexin V-PI)染色用于检测各组HK-2细胞凋亡情况。蛋白质印迹法用于检测Akt-Foxo3a-Nrf2调控轴蛋白的表达水平。结果Scr检测结果显示,Mod组大鼠的Scr水平[(58.83±7.96)μmol/L比(23.52±0.78)μmol/L]高于Con组,M+B组Scr水平[(39.64±2.52)μmol/L比(58.83±7.96)μmol/L]低于Mod组(P均<0.05)。HE染色结果显示,Con组大鼠肾脏形态正常,肾小管上皮细胞完好,Mod组大鼠肾脏中肾小管结构受损,大量肾小管上皮细胞死亡,肾小管上皮细胞空泡样变明显,M+B组大鼠肾脏中部分肾小管形态恢复,肾小管上皮细胞空泡样变减少,细胞死亡减少。蛋白质印迹法表明,与Con组相比,在Mod组大鼠和HK-2细胞中磷酸化蛋白激酶B(Phospho-protein kinase B,p-Akt)表达增加,差异均具有统计学意义(P均<0.05);M+B组p-Akt表达较Mod组下降(P<0.05);Annexin V-PI凋亡检测显示,与Con组相比,Mod组中HK-2细胞凋亡[(12.65±1.25)%比(27.44±0.73)%]增加,与Mod组相比,M+B组中HK-2细胞凋亡[(27.44±0.73)%比(24.81±0.49)%]下降(P均<0.05)。与M+B组相比,BBR与Akt激动剂联合治疗组HK-2细胞凋亡[(24.81±0.49)%比(27.50±0.35)%]增加(P<0.05)。与Mod组相比,Akt抑制剂治疗组HK-2细胞凋亡[(27.65±0.56)%比(25.20±0.64)%]减少(P<0.05)。与M+B组相比,MK2206与BBR联合使用能够进一步减少碘佛醇诱导的HK-2细胞凋亡[(24.51±0.52)%比(21.24±0.99)%,P<0.05]。结论BBR通过调控Akt-Foxo3a-Nrf2轴,在体内和体外发挥抑制CIN的作用,该作用机制是p-Akt依赖性的。

Asporin在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及临床意义

目的探讨无孢蛋白(Asporin)在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及临床意义。方法收集2019年12月⁃2021年11月选取涟水人民医院收治的140例食管鳞状细胞癌患者。随机选取60例新鲜切取的食管鳞状细胞癌(ESCC)组织及癌旁正常组织,利用Western blot、RT⁃PCR技术检测Asporin的蛋白及mRNA表达水平;80例ESCC组织及其相应癌旁组织的石蜡标本,利用免疫组化技术进一步检测Asporin的表达情况;利用卡方检验、Kaplan⁃Meier分析以及COX回归分析验证Asporin的表达与ESCC患者临床病理特征及预后的关系;Transwell侵袭实验研究Asporin沉默后对ESCC细胞株侵袭转移功能的影响;Pearson相关分析评价Asporin与基质金属蛋白酶2(MMP2)之间的相关性。结果Western blot和RT⁃PCR结果显示ESCC的Asporin蛋白和mRNA表达水平明显高于其癌旁正常组织(P<0.05);免疫组化结果显示,Asporin在ESCC组织中的表达明显高于癌旁组织,且Asporin在ESCC的高表达率为65%(52/80);Asporin表达水平与患者的淋巴结转移情况及TNM分期有显著相关性(P<0.05),与其他临床病理特征无显著相关性(P>0.05);Kaplan⁃Meier分析结果表明,高表达Asporin的ESCC患者无病生存期短于低表达ASPN的患者(P<0.01);COX回归分析显示,低表达Asporin的ESCC患者死亡风险低于高表达ASPN的患者,HR=0.106(95%CI:0.024⁃0.469),Asporin是影响ESCC患者预后的独立危险因素(P=0.003);Transwell侵袭实验表明,经siRNA沉默Asporin后,与阴性对照组相比,Asporin敲低组的侵袭能力明显降低;Pearson相关分析显示,Asporin的表达水平与MMP2表达存在中度正相关关系(r=0.61,P<0.01),MMP2在恶性肿瘤侵袭转移过程中起关键作用。结论Asporin可能作为一种癌基因,参与食管鳞状细胞癌的发生发展。

过表达CircBTG2对食管鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响及其分子机制

目的观察环状RNABTG2(CircBTG2)在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达变化,以及过表达CircBTG2对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭、集落形成等生物学行为的影响及其分子机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测ESCC组织(33例份)及正常食管黏膜组织(13例份)中CircBTG2相对表达量。将人ESCC细胞系KYSE150分为三组,CircBTG2过表达组转染CircBTG2过表达载体,空载体组转染空白载体,对照组不进行转染,作用6 h。采用CCK-8法检测三组细胞培养24、48、72、96 h的细胞增殖能力(以OD450表示),细胞划痕实验、细胞侵袭实验和集落形成实验记录三组细胞的迁移距离、侵袭细胞数、集落形成数。双荧光素酶报告基因实验检测CircBTG2与miR-92b-3p结合情况。结果正常食管黏膜组织、ESCC组织中CircBTG2相对表达量分别为4.75±1.15、3.21±1.25,两者比较P<0.01。培养24、48 h,三组细胞OD450比较P均>0.05;培养72、96 h,过表达组OD450明显低于对照组和空载体组(P均<0.05);过表达组细胞迁移距离、侵袭细胞数、集落形成数均明显低于对照组和空载体组(P均<0.05)。对照组和空载体组OD450及细胞迁移距离、侵袭细胞数、集落形成数比较P均>0.05。双荧光素酶报告基因实验结果显示,共转染野生型CircBTG2和miR-92b-3p模拟物的KYSE150细胞荧光素酶活性降低(P<0.01)。结论ESCC组织中CircBTG2表达降低,过表达CircBTG2可能通过与miR-92b-3p结合而抑制ESCC细胞增殖、迁移、侵袭及集落形成等生物学行为。

循环微小RNA-188-5p在冠状动脉造影术后对比剂肾病的预测价值

目的 观察冠状动脉(冠脉)造影术后循环微小RNA-188-5p(miR-188-5p)的变化,探讨其在对比剂肾病(CIN)发生中的预测价值。方法 从GEO数据库获得GSE81400和GSE130796表达矩阵并分析miR-188-5p在CIN大鼠血浆及肾脏中的表达;选取2020年6月至2020年12月于南京医科大学第一附属医院心血管内科行冠脉造影术后并发CIN患者作为CIN组,另按1:3比例纳入同时期无并发CIN的患者作为对照组,实时荧光定量PCR检测冠脉造影术前及术后12 h患者循环miR-188-5p表达,分析其临床意义。结果 分析GEO数据库中数据集显示CIN大鼠血浆中(1.116±0.034 vs. 1.00±0.031,P=0.005)及肾脏中[(GSE81400:1.860±0.309 vs. 1.00±0.051),P=0.003;(GSE130796:2.360±0.317 vs. 1.00±0.497),P=0.031]的miR-188-5p表达高于对照组;共纳入CIN患者42例及非CIN患者126例,两组患者性别、血肌酐(SCr)值、血尿素氮(BUN)、药物使用情况及miR-188-5p表达量无显著差异(P均>0.05)。但两组患者在年龄(67.7±9.7 vs. 64.2±9.5,P=0.042)、合并糖尿病(52.4%vs. 26.2%,P=0.002)及贫血(21.4%vs. 9.5%,P=0.043)、造影剂用量(126.4±28.6 vs. 117.1±21.8,P=0.030)方面存在差异;造影剂应用12 h后,CIN组患者循环miR-188-5p表达水平高于对照组(1.852±0.890 vs.1.266±0.537,P<0.001);单因素及多因素logistic回归分析显示年龄(OR=1.016,P=0.033)、糖尿病(OR=3.582,P=0.004)、造影剂用量(OR=1.026,P=0.004)及术后miR-188-5p表达量(OR=2.835,P=0.001)与发生CIN密切相关。结论 循环miR-188-5p具有作为CIN预测标志物的潜力。

B细胞易位基因2在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨B细胞易位基因2(BTG2)在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达及临床意义。方法:分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中BTG2 mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的表达,受试者工作特征(ROC)曲线分析BTG2 mRNA表达量在预测ESCC患者疾病状态和放疗敏感性中的诊断价值;免疫组织化学检测我院184例ESCC患者癌组织标本BTG2蛋白表达,其中包括55例行根治性放疗术的ESCC患者,50例正常黏膜组织作为对照。分析BTG2蛋白表达情况与ESCC临床特征的关系。结果:与对照组比较,BTG2 mRNA在ESCC组织中表达下降(5.08±1.06 vs 5.91±1.29,t=2.387,P=0.019),与放疗敏感组患者比较,BTG2 mRNA在放疗抵抗的ESCC患者癌组织中表达下降(3.82±0.97 vs 5.44±0.73,t=4.935,P<0.001),ROC结果显示BTG2 mRNA在鉴别放疗敏感与放疗抵抗患者时特异性为95.65%,敏感性为75%(AUC=0.902,P<0.001);免疫组织化学结果显示ESCC组织中BTG2阳性表达(103/184)低于正常黏膜组织(42/50),差异有统计学意义(χ^(2)=13.10,P<0.001);BTG2表达在放疗敏感和放疗抵抗组织中的阳性表达率分别为57.9%(22/38)和23.5%(4/17),差异有统计学意义(χ^(2)=5.565,P=0.018);ESCC患者BTG2蛋白表达差异在不同性别、年龄、T分期及M分期中无统计学差异(P>0.05),与N分期(χ^(2)=4.134,P=0.042)及临床分期(χ^(2)=5.303,P=0.021)相关;单因素分析结果显示,肿瘤分级(HR=0.500,95%CI:0.317~0.790,P=0.003)、N分期(HR=0.275,95%CI:0.157~0.479,P=0.000)、M分期(HR=0.317,95%CI:0.151~0.665,P=0.002)、临床分期(HR=0.269,95%CI:0.167~0.434,P=0.000)及BTG2表达(HR=1.956,95%CI:1.242~3.079,P=0.003)与ESCC患者总生存(OS)有关;多因素分析结果显示,肿瘤分级(HR=0.613,95%CI:0.381~0.987,P=0.044)、N分期(HR=0.507,95%CI:0.259~0.991,P=0.047)、临床分期(HR=0.504,95%CI:0.278~0.916,P=0.025)及BTG2表达(HR=1.608,95%CI:1.011~2.558,P=0.045)影响ESCC患者的OS。结论:BTG2具有作为预测ESCC进展及放疗敏感性生物标记物的潜在价值,并且是影响ESCC患者总生存率的独立预后因素。

小檗碱通过调节KEAP1/Nrf2/FOXO3A信号通路减轻造影剂肾病

目的探讨小檗碱减轻造影剂肾病(CIN)的作用及其可能机制。方法30只SD大鼠随机均分为对照组(A组)、小檗碱组(B组)、CIN模型组(C组)、小檗碱治疗组(D组)和阿托伐他汀治疗组(E组)。检测大鼠SCr和BUN水平,HE染色评估肾小管损伤情况,测定肾脏组织中谷胱甘肽(GSH)含量,透射电子显微镜下观察小鼠肾脏组织线粒体损伤,TUNEL染色评估肾脏细胞凋亡情况,Western blot法检测Bcl-2、谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP1)、核因子2相关因子2(Nrf2)和叉头蛋白O3A(FOXO3A)蛋白表达,免疫组织化学染色检测SLC7A11、GPX4、Nrf2和FOXO3A的表达。结果C组SCr和BUN水平、肾脏细胞凋亡、肾小管损伤组织学评分高于A组和B组(P<0.01);而D组和E组SCr和BUN水平、肾脏细胞凋亡、肾小管损伤组织学评分低于C组(P<0.05或P<0.01)。HE染色结果显示,C组肾小管闭塞,并伴随大量肾小管结构破坏和溶解,细胞内可见空泡样变性;D组肾小管结构较少被破坏,细胞空泡样变性减少。C组GSH含量少于A组(P<0.05);而D组GSH含量高于C组(P<0.05)。透射电子显微镜下可见C组线粒体体积缩小、膜密度增高、嵴数量减少,而D组和E组线粒体形态、嵴数量得到恢复,线粒体体积趋于正常,并可见自噬小体和自噬溶酶体形成。C组GPX4、Bcl-2和FOXO3A蛋白表达低于A组和B组(P<0.01);与C组相比,D组Bcl-2、GPX4、SLC7A11、Nrf2和FOXO3A蛋白表达增加,KEAP1蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论小檗碱通过促进KEAP1/Nrf2/FOXO3A信号通路的活化抑制铁死亡,进而减轻碘佛醇诱导的大鼠CIN。

白藜芦醇对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞氧化应激损伤的保护作用

目的探讨白藜芦醇(RSV)对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)引起的足细胞氧化应激损伤的保护作用及可能机制。方法将小鼠肾脏足细胞系MPC5分为空白对照组(A组)、PAN处理组(B组)和PAN+RSV处理组(C组)。采用台盼蓝染色法和流式细胞术分别检测足细胞活力和凋亡情况,共聚焦显微镜下观察细胞骨架排列情况,DCFH-DA染色检测足细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,羟胺法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量。结果与A组相比,B组小鼠足细胞活力、SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05),足细胞凋亡以及ROS、LDH和MDA含量增加(P<0.05),足细胞骨架出现紊乱、重组和降解,并向边缘聚集;而C组经RSV干预后各项观察指标均得到有效改善(P<0.05)。结论 RSV可以部分逆转PAN诱导的足细胞损伤,其保护作用可能与抑制氧化应激、改善线粒体功能障碍相关。

四号染色体开放式阅读框19通过调节氮代谢参与结直肠腺癌恶性表型

目的通过基因共表达网络筛选与结直肠腺癌(COAD)发展相关的关键基因,并初步验证其潜在功能。方法从肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库下载COAD患者基因表达谱和临床信息,包括379例COAD患者及39例对照,Kaplan-Meier分析得到COAD预后相关基因后进行权重基因共表达模块(WGCNA)分析;最终获得关键基因后结合分子实验初步验证其功能及潜在机制;多组均数比较采用Kruskal-Wallis检验、两组均数比较采用Mann-whitneyU检验,相关性分析使用Pearson检验。结果共筛出3 170个预后相关基因;WGCNA构建出9个基因模块,其中Brown模块不仅与COAD呈负相关,且与临床分期、TNM分期呈负相关;Brown模块的中心基因C4orf19在COAD肿瘤组织中表达低于对照组[4.37 (4.10~4.49)比2.70 (2.18~3.18),U=684,P<0.01],并且与临床分期(H=9.442,)、T分期(H=9.336)、M分期(U=5 842)和N分期(U=14 572)相关(P均<0.05);免疫组织化学示C4orf19在癌组织组表达低于癌旁组,阳性例数分别为11(27.5%)和35(87.5%),差异有统计学意义(χ^(2)=29.460,P<0.01);沉默C4orf19后,结肠癌细胞增殖(4.494±0.438比3.415±0.453,t=-4.527)、迁移(15.007±0.439比7.583±0.701,t=12.69)及侵袭能力(154.000±4.546比96.667±4.643,t=12.48)高于对照组(P<0.01)。结论 WGCNA是一种有效的系统生物学方法,通过此方法识别出新的抑癌基因C4orf19。

整合转录组学识别食管鳞癌关键基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3

目的运用整合转录组学方法筛选参与食管鳞状细胞癌(ESCC)发生发展的相关基因,并观察其临床意义。方法从GEO数据库中下载ESCC表达谱的原始文件,使用R软件中的affy包读取数据并归一化,Robustrankaggreg包对各表达谱整合,以|Log2(倍数变化)|≥1.5和矫正P<0.05为标准获得差异表达基因(DEGs);利用STRING数据库构建蛋白质互作网络(PPI),cytoscape软件及MCODE插件进行网络可视化及模块挖掘,获取模块内的关键基因;采用癌症基因组图谱(TCGA)验证关键基因在ESCC组织及癌旁组织中的表达,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析关键基因对ESCC的诊断价值;免疫组化检测我院184例ESCC患者癌组织标本及50例癌旁组织中关键基因的蛋白表达,分析蛋白表达与临床特征的关系。结果通过整合数据集GSE77861、GSE100942、GSE26886、GSE17351、GSE38129、GSE33426、GSE20347、GSE23400,最终获得DEGs 244个,其中上调93个、下调151个;构建PPI网络后,模块挖掘显示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(CDKN3)被识别为模块内关键基因;TCGA验证结果显示,与癌旁组织比较,CDKN3 mRNA在ESCC组织中表达上调[3.291(IQR:2.833~3.659)vs 1.184(IQR:0.734~1.72),U=18.00,P<0.05];ROC曲线显示,曲线下面积为0.980,CDKN3 mRNA诊断ESCC的特异性为90.91%,敏感性为92.59%;免疫组化显示,ESCC组织中CDKN3的阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、T及M分期的ESCC患者CDKN3蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同N分期及临床分期的ESCC患者CDKN3蛋白表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CDKN3在ESCC组织及癌旁组织中表达存在差异,其可能是ESCC的关键基因;另外,CDKN3的表达与患者N分期及临床分期有关,其可作为诊断ESCC的生物标志物。