重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。