气液界面培养体外构建角膜上皮的实验研究

目的:建立气液界面培养体外构建兔角膜上皮的方法。评价体外构建角膜上皮的生物学特性。方法:新西兰白兔15只30只眼,取角膜缘上皮组织。组织块接种原代培养。细胞融合生长后,消化传代。以去上皮细胞人羊膜组织为载体,接种培养传代细胞,细胞融合后,用气液界面培养方法继续培养周。倒置显2微镜对体外构建的角膜上皮进行观察。培养细胞膜片固定,苏木精-伊红(H)E染色;AE1细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色,光镜观察。常规制作电镜标本,透射电镜观察。以传统培养方法作为对照。结果:倒置显微镜观察,气液界面培养可以形成连续的上皮细胞层,细胞和载体之间连接较牢固。HE染色显示体外构建的角膜上皮具有复层扁平上皮的结构。免疫组化染色有较高的阳性率。透射电镜观察细胞之间有丰富的桥粒样连接。结论:气液界面培养方法可以构建复层鳞状角膜上皮。与传统培养方法比较,构建的角膜上皮组织具有较优越的生物学特性。

自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

目的:用组织工程方法构建角膜上皮组织,观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性。方法:①实验于2000-01/2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成。选用新西兰白兔15只,雌雄不拘。用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型,为移植实验的受体眼。另一只眼为供体眼。15只兔被随机分为3组:自体角膜上皮移植,羊膜移植组,对照组。②自体角膜上皮移植组:取供体眼角膜缘上皮组织约3mm3,体外培养。对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察,采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色;采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达;对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察。在去除上皮的保存人羊膜组织上,接种培养细胞,气液界面培养2周构建复层上皮组织。倒置显微镜观察细胞形态和生长特征;组织固定,包埋,切片,染色,观察细胞生长状态和蛋白表达。透射电镜观察超微结构。5只眼成模后4周,受体眼去除角膜浅层新生血管膜,行自体培养角膜上皮移植术。羊膜移植组:5只眼成模后4周,行羊膜移植修复角膜表面;对照组:5只眼成模后不做处理,为模型对照组。③移植实验后7,10,20,30d,分别行裂隙灯显微镜检查,角膜荧光素染色,眼前部照相。并分别处死各组动物,取手术区域角膜组织,甲醛固定,石蜡包埋,病理切片,染色,镜检观察。结果:①培养细胞的生长状态:原代培养48h细胞贴壁,15d左右形成单层。传代培养次日细胞贴壁,10d形成良好的单层。细胞胞体饱满,呈多角形,大小基本一致。②培养细胞的形态学特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,核呈长圆形,细胞大小一致,排列整齐。AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性。③培养细胞的超微结构:透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接,缝隙连接。扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构。④羊膜上接种细胞的生长特征:24h细胞贴壁生长,1周左右融合成单层。气液界面培养,细胞透明饱满,均匀成片生长,持续培养2周,细胞呈复层生长。⑤组织工程化角膜上皮形态特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,在羊膜上融合成片。组织切片,细胞在羊膜上可达到四五层。透射电镜可见桥粒样结构。⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验:自体角膜上皮移植组:移植区角膜上皮细胞覆盖,呈复层排列,基底细胞呈柱状,基底膜完整。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。供体角膜未出现临床病理性损伤。羊膜移植组:移植区域表层有上皮细胞覆盖,层次紊乱,极性消失。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。对照组:角膜上皮排列紊乱,基底膜不完整,基质内有中性白细胞和红细胞浸润。结论:①角膜干细胞在体外能够培养传代。②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长,经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似。③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症。

hRad17在浸润性乳腺癌中表达及其与细胞增殖、凋亡的关系

目的探讨乳腺癌组织中hRad17表达及其与细胞增殖、凋亡之间的关系。方法采用免疫组化SP法检测90例乳腺浸润性癌、8例乳腺原位癌及20例乳腺良性病变组织中hRad17表达。测定90例乳腺浸润性癌组织中K i-67、微小染色体维持蛋白7(m in ichromosom e m aintenance prote ins,MCM7)、Bc l-2、p53、ER、PR、c-erbB-2的表达。结果 hRad17蛋白在乳腺浸润性癌、乳腺原位癌和乳腺良性病变三组病例中表达差异有统计学意义(P<0.05)。90例乳腺浸润性癌中,hRad17阳性表达56例(62.2%)。乳腺浸润性癌的hRad17的阳性表达与乳腺癌的临床分期、组织学分级、淋巴结转移及K i-67、MCM7、Bc l-2表达密切相关,与患者生存期呈负相关(P<0.05)。hRad17的表达与患者年龄、肿块大小、组织学类型和p53、ER、PR、c-erbB-2表达均无关(P>0.05)。结论 hRad17在乳腺癌中表达上调,提示在乳腺癌发生、发展中起重要作用。hRad17可成为判断乳腺癌预后新的分子标记物。

CINⅠ的转归及p16INK4a蛋白表达在分流CINⅠ中的临床意义

目的：探讨子宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ的转归，分析影响CINⅠ病变进展的相关因素，并评价p16INK4a蛋白表达在预测CINⅠ病变进展中的价值。方法回顾性分析2010年8月—2013年7月在南京医科大学第一附属医院就诊，初次液基薄层细胞学检查（TCT）结果为≤低度鳞状上皮内病变[LSIL；包括正常、未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）和LSIL]且高危型HPV阳性，并经阴道镜下子宫颈活检组织病理诊断为CINⅠ的患者104例，随访1年观察病变的转归，同时对患者年龄、初次TCT结果、高危型HPV DNA载量、子宫颈脱落细胞中HPV L1壳蛋白及子宫颈组织中p16INK4a蛋白表达情况与CINⅠ病变进展的关系行单因素及多因素分析。结果（1）104例CINⅠ患者中，初次检查TCT结果正常者15例、ASCUS 78例、LSIL 11例；1年后随访时复查：TCT结果正常且高危型HPV阴性者52例，高危型HPV阳性和（或）TCT结果≥正常但经阴道镜检查评估并行子宫颈活检组织病理检查诊断为正常者30例、CINⅠ10例、CINⅡ5例、CINⅢ7例。78.8%（82/104）的患者病变消退；9.6%（10/104）的患者病变持续；11.5%（12/104）的患者病变进展，其中4.8%（5/104）病变进展为CINⅡ，6.7%（7/104）进展为CINⅢ，无一例进展为子宫颈浸润癌。（2）104例CINⅠ患者中，行p16INK4a蛋白检测者88例，其中30例（34%，30/88）p16INK4a蛋白呈阳性表达，58例（66%，58/88）p16INK4a蛋白呈阴性表达；行免疫细胞化学HPV L1壳蛋白检测者94例，其中49例（52%，49/94）HPV L1壳蛋白阳性表达，45例（48%，45/94）HPV L1壳蛋白阴性表达。（3）单因素分析显示，患者年龄、高危型HPV DNA载量、初次TCT结果、HPV L1壳蛋白表达与CINⅠ病变进展无明显相关关系（P〉0.05），而p16INK4a蛋白阳性表达与CINⅠ病变进展明显相关（P〈0.05）。多因素分析显示，p16INK4a蛋白阳性表达是影响CINⅠ病变进展的危险因素（OR=5.1，95%CI为1.162～22.387，P=0.031）。（4）30例p16INK4a蛋白阳性表达的CINⅠ患者中8例（27%，8/30）病变进展，58例p16INK4a蛋白阴性表达者中4例（7%，4/58）病变进展，两者比较，差异有统计学意义（P〈0.05）。p16INK4a蛋白阳性表达预测CINⅠ病变进展的敏感度为75%，特异度为71%，阳性预测值27%，阴性预测值93%。结论高危型HPV阳性且TCT结果≤LSIL的CINⅠ患者1年内病变进展率较低，无子宫颈浸润癌发生。p16INK4a蛋白阳性是影响CINⅠ病变进展的危险因素，对于预测CINⅠ病变进展有一定的价值，可用于分流CINⅠ，筛查出高危人群进行重点随访。