心肌病心肌肌钙蛋白I磷酸化及降解的初步研究

目的探讨心肌肌钙蛋白 I(cTnI)在心室扩张、心力衰竭患者心肌组织中的磷酸化与降解及其信号通路调节。方法 4例原发性扩张型心肌病患者。3例其他病因继发心室扩张,心脏移植术受体心脏,1例行双瓣膜置换及左心室改良术,部分左心室切除心肌组织。6例正常心脏。分别行光镜、电镜病理学检测,Western blot 方法检测左心室心肌组织 cTnI 磷酸化、去磷酸化,cTnI 降解片段及蛋白激酶 C(PKC)表达,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参半定量。结果扩张左心室心肌内均检测到 cTnI 表达及降解片段,正常左心室心肌内均可见 cTnI 表达,未见降解条带。扩张左心室心肌均有明显磷酸化 cTnI 表达,半定量结果均明显高于正常对照组(P<0.05),两组心肌病表达比较差异无统计学意义。扩张左心室心肌内均可见程度不同的去磷酸化 cTnI 表达,正常组未出现明显去磷酸化 cTnI 表达。扩张左心室及正常对照组左心室心肌组织内均未检测到明显的 PKCβ1、PKCβ2表达。结论扩张心室心肌组织内 cTnI 降解片段的存在可能与心肌病变的发生、发展有关,并在长期慢性心功能的损害中起重要作用。衰竭心肌组织内 cTnI 磷酸化程度显著增强,PKCβ1、PKCβ2与其磷酸化程度增高可能不相关。

肥厚型心肌病心肌肌钙蛋白I R145W突变对大鼠心肌细胞钙调控的影响

目的探讨国人新的致肥厚型心肌病(HCM)心肌肌钙蛋白 I 基因突变(eTnI R145W)引起 HCM 发病的可能机制。方法采用定点突变技术在大鼠 cTnI cDNA 引入 R146W(相当于人R145W)突变,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)做报告基因,构建含野生型和突变型大鼠 cTnI cDNA 的重组腺病毒载体。Langendoff 逆流灌注系统分离成年大鼠心肌细胞,无血清法培养后重组腺病毒转染。Western blot 检测重组蛋白的表达,全膜片钳技术记录心肌细胞膜 L 型钙电流,Fura-2/AM 孵育后测定细胞内游离钙离子浓度和咖啡因诱导的肌浆网钙释放。结果 DNA 测序证实 R146W 突变成功引入大鼠 cTnI cDNA。新鲜分离的成年大鼠心肌细胞存活率达70%～80%,无血清培养7天后绝大部分能保持长杆状形态。重组腺病毒转染48h 后荧光显微镜下可观察到绿色荧光,cTnI 和绿色荧光蛋白单抗均能检测到重组蛋白。与野生型 cTnI 和正常对照组比较,突变型 cTnI 组心肌细胞膜 L 型钙电流峰值明显降低。Fura-2/AM 法测定细胞内游离钙离子浓度和咖啡因诱导的肌浆网钙释放,三组之间差异无统计学意义。结论含 R146W 突变的 cTnI 蛋白可能引起心肌细胞的电生理学重构,进一步研究可探讨肌丝对钙的敏感性及钙调节蛋白表达的改变。