C-反应蛋白对体外培养乳鼠心肌细胞的影响

目的:应用C-反应蛋白干预体外培养的乳鼠心肌细胞,观察C-反应蛋白对心肌细胞的影响。方法:实验于2005-05/10在南京医科大学第一附属医院心内科暨心血管病研究所完成。取新生1～3d的SD乳鼠,无菌操作取出心脏,去除大血管和心房后将心脏剪碎,加入适量0.125%胰蛋白酶反复消化至完全。所得消化液中加入含血清的DMEM培养基,离心后弃上清,沉淀用含0.1%Brdu、体积分数为0.15新生牛血清的DMEM培养基混悬。细胞密度稀释至6×108L-1,接种至六孔板中,放入37℃,体积分数为0.05的CO2孵育箱内培养。24h后换液除去Brdu,取第3天细胞进行研究。采用充氮气孵育4h模拟缺氧造成心肌细胞损伤(缺氧组),以未缺氧组做对照,缺氧组与未缺氧组均加用不同浓度的C-反应蛋白(0,10,55,100mg/L)进行干预,测定细胞培养上清心肌肌钙蛋白Ⅰ的含量及脂质过氧化产物丙二醛与超氧化物歧化酶的含量以观察C-反应蛋白对心肌细胞的影响,并通过免疫组织化学观察C-反应蛋白在细胞的分布情况。结果:①细胞形态及搏动率的改变:未缺氧组细胞搏动率总体随C-反应蛋白浓度的增加而增加,但在缺氧4h组,细胞搏动率在C-反应蛋白55mg/L时达到最高峰犤(132±9)次/min,P<0.05犦。②培养细胞上清肌钙蛋白Ⅰ含量的变化:在未缺氧组和缺氧4h组,肌钙蛋白Ⅰ均随C-反应蛋白浓度的增加而增高,且C-反应蛋白浓度为100mg/L时的增幅最高犤C-反应蛋白为0,10,55,100mg/L时的肌钙蛋白Ⅰ浓度:缺氧组分别为(0.789±0.066),(1.198±0.101),(1.979±0.151),(3.714±0.288)μg/L;未缺氧组分别为(0.332±0.034),(0.377±0.054),(0.527±0.057),(0.867±0.077)μg/L,P<0.05犦。③细胞上清超氧化物歧化酶、丙二醛含量变化:各组丙二醛含量的变化趋势与肌钙蛋白Ⅰ相似,随C-反应蛋白浓度的增加而增加,而超氧化物歧化酶活力则随C-反应蛋白浓度的增加而降低。④免疫组织化学结果显示:随着C-反应蛋白浓度的增高,细胞着色变深,细胞密度变低,体积变小。相同C-反应蛋白浓度下,损伤组细胞的变化比未缺氧组更明显。结论:C-反应蛋白对心肌细胞具有显著的损伤作用,尤其在已有缺氧损伤的基础上。

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。