嵌合抗原受体修饰的诱导多能干细胞来源的M1极化的巨噬细胞治疗肝癌的研究

目的:探讨嵌合抗原受体(CAR)修饰的诱导多能干细胞(iPSCs)分化的M1型巨噬细胞(MΦ)治疗肝细胞肝癌的应用研究。方法:选用前期构建的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3^(-)scFv)且含有MΦ特异性胞内区域结构的CAR元件慢病毒载体感染人iPSCs,获得CAR修饰的iPSCs即CAR-iPSCs,分化为MΦ,命名为CAR-iM(由iPSCs分化的巨噬细胞称为iM),进而极化成M1型MΦ,命名为CAR-iM1。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、流式细胞术、酶联免疫吸附试验检测CAR-iM1的体外抗肿瘤功能。进一步在B-NDG裸鼠体内构建GPC3^(+)肝癌细胞Hep-3B的皮下移植瘤模型,分别不做处理、注射3×10^(6) iM1和3×10^(6) CAR-iM1,观察裸鼠体内肿瘤生长情况、存活时间、肿瘤内肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的表型。两组间差异比较采用配对样本t检验,多组间差异比较采用方差分析(ANOVA)。结果:FCM检测CAR-iPSCs的绿色荧光蛋白(GFP)阳性表达率分别为89.7%,RT-qPCR检测CAR-iPSCs的GPC3^(-)scFv和GFP表达显著高于iPSCs[F(1,8)=266.6,P<0.05]。iPS组、EBs D4组的LIN28A显著高于iMc组(6.53±0.23、3.44±0.08比0.50±0.01,t=44.53、61.85,P<0,05),iPS组、EBs D4组的POU5F显著高于iMc组(5.35±0.36、5.55±0.15比0.50±0.01,t=23.37、58.16,P<0.05)。成功建立CAR-iPSCs细胞系,分化为CAR-iM并极化为CAR-iM1。共培养实验结果显示,CAR-iM1对Huh7细胞(GPC3^(-))的吞噬与iM1比较差异无统计学意义(16.97±0.40比14.10±1.11,t=4.19,P>0.05);于Hep-3B(GPC3^(+))细胞,CAR-iM1的吞噬效应高于iM1(34.60±0.78比14.97±2,27,t=14.15,P<0.05)。iM1与Huh7、Hep-3B细胞共培养时分泌的白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)显著高于iM1单独培养(183.20±2.73、194.60±4.02比94.32±3.97,t=31.96、30.47,P<0.05);CAR-iM1与Huh7、Hep-3B细胞共培养时分泌的IL-6和TNF-α显著高于CAR-iM1单独培养(101.80±18.44比185.50±24.29、314.20±24.22,t=4.75、12.09,P<0.05);与Hep-3B细胞共培养时CAR-iM1分泌的IL-6和TNF-α水平高于Huh7细胞共培养组(314.20±24.22比185.50±24.29,t=6.50,P<0.05);CAR-iM1单独培养、与Huh7细胞共培养与iM1比较差异无统计学意义(94.32±3.97比101.80±18.44、183.20±2.73比185.50±24.29,t=0.68、0.16,P>0.05),而与Hep-3B细胞共培养时CAR-iM1分泌的IL-6和TNF-α水平高于iM1(194.60±4.02比314.20±24.22,t=8.43,P<0.05)。在GPC3^(+)肝癌移植瘤模型小鼠体内,CAR-iM1治疗组肿瘤生长速度显著低于对照组[F(5,5)=1685,P<0.05],且在第60天的存活数显著高于对照组(χ^(2)=13.68,P<0.05)。FCM结果提示,CAR-iM1治疗组肿瘤内M1表型MΦ占所有TAMs比例显著高于iM1治疗组(73.90±3.16比17.53±2.01,t=26.05,P<0.05)。结论:CAR-iM1对GPC3^(+)肝癌细胞有特异性抑制作用。

基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和巨噬细胞特异性胞内区域的嵌合抗原受体的构建

目的:构建基于肝癌标志物磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)和巨噬细胞(MΦ)特异性胞内区域结构的嵌合抗原受体(CAR)并验证其功能。方法:采用基因重组的方法,构建2种编码抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3 -ScFv)的CAR的慢病毒载体:含T细胞胞内区域结构的t-CAR和含MΦ特异性胞内区域结构的m-CAR。包装慢病毒并感染人THP-1细胞,制备成t-CAR-THP-1和m-CAR-THP-1,由THP-1、t-CAR-THP-1和m-CAR-THP-1分化的M1型MΦ分别命名为M1、t-CAR-M1和m-CAR-M1。采用共培养、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和流式细胞术(FCM)检测两种CAR修饰的M1体外的抗肿瘤功能。进一步在B-NDG小鼠体内构建GPC3阳性肝癌细胞Hep-3B的皮下移植瘤模型,以不做处理作为对照组,注射3×10^(6) M1、3×10^(6) t-CAR-M1和3×10^(6) m-CAR-M1作为实验组,观察裸鼠体内肿瘤生长情况以及裸鼠存活时间。两组间差异比较采用配对样本 t检验,多组间差异比较采用方差分析(ANOVA)。 结果:成功构建靶向GPC3的t-CAR和m-CAR慢病毒载体,制备了t-CAR-THP-1和m-CAR-THP-1细胞,并获得M1、t-CAR-M1和m-CAR-M1,RT-qPCR结果显示,t-CAR-THP-1组和m-CAR-THP-1组GPC3 -ScFv和绿色荧光蛋白(GFP)表达高于THP-1组(9.43±0.21、11.97±1.01比1.00±0.00, t=68.40、18.91, P<0.05)。在体外功能实验中,t-CAR-THP-1和m-CAR-THP-1细胞能够特异性地亲和GPC3蛋白。FCM结果显示,t-CAR-M1和m-CAR-M1对Huh7细胞(GPC3 -)的吞噬差异无统计学意义(10.93±1.10比11.30±0.46, t=0.53, P>0.05),而t-CAR-M1组和m-CAR-M1组的吞噬效应高于M1组(10.93±1.10、11.30±0.46比8.29±0.63, t=3.60、6.67, P<0.05),同时,t-CAR-M1和m-CAR-M1对Hep-3B细胞的吞噬效率显著高于对Huh7细胞(21.57±0.66、27.30±1.58比10.93±1.10、11.30±0.46, t=15.27、16.19, P<0.05)。在GPC3阳性肝癌移植瘤模型小鼠体内,t-CAR-M1和m-CAR-M1治疗组肿瘤生长速度显著低于第一组和第二组[ F(5,15)=6.86, P<0.05],m-CAR-M1组的存活率高于对照组、M1组、t-CAR-M1组( χ^(2)=5.05、5.02、2.09, P<0.05)。 结论:含有MΦ特异性胞内区域的m-CAR修饰的MΦ在体外和体内对GPC3 +肝癌细胞的抑制作用强于t-CAR。